《Talanta》：Evaluating limits of detection for single-cell elemental bioimaging by LA-ICP-TOFMS
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荧光生物传感器检测MRSA中arlR基因转录研究，结合Exo III辅助目标回收和Nb.BbvCI驱动多足DNA漫步技术，实现高灵敏度（87 aM）和快速（6分钟）的arlR mRNA检测，为耐药机制研究和中药单体抑制提供新方法。
陈华英|唐可欣|徐佳欣|宁毅
湖南中医药大学医学院微生物学系，中国湖南省长沙市410208
摘要
药物外排是细菌多重耐药性的主要原因，这导致了医院和社区环境中持续存在的感染问题。因此，开发新的方法来追踪这一过程并解决这一问题对于临床诊断和治疗非常重要。本研究开发了一种荧光生物测定方法，利用Nb.BbvCI驱动的多足DNA行走器结合外切核酸酶III（Exo III）辅助的目标回收和杂交链反应（HCR），检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中arlR基因的转录。目标序列HP1被Exo III切割后，DNA行走器能够在磁珠表面移动。这一过程导致目标序列的回收并形成多足DNA行走器。新形成的多足DNA通过Nb.BbvCI对HP2的切割，在羧基化氧化石墨烯（CGO）表面自主移动，生成大量触发探针（TPs）。这些TPs在HP3和HP4的辅助下启动HCR反应，产生双链DNA（dsDNA）。这些dsDNA产物被氧化石墨烯（GO）排斥并产生强烈的荧光。重要的是，由于荧光叠加效应，SYBR Green I的使用大大增强了荧光强度。该方法实现了0.1 fM到100 pM的良好线性检测范围，检测限为87 aM。此外，该生物测定方法还能有效检测实际样本中的目标RNA。这种方法为arlR转录提供了灵敏且快速的分析手段，在药物筛选和药物作用机制研究中具有重要的应用价值。
引言
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种引起社区和医院获得性感染的病原体，是肺炎、假膜性结肠炎、败血症、心包炎和多器官功能障碍综合征等疾病的主要原因，对公共健康和安全构成重大威胁[1]，[2]。近年来，抗生素的过度使用和不当使用导致许多MRSA菌株的多重耐药性（MDR）迅速增加，这是由于外排泵的过度产生。这些外排泵是跨膜通道蛋白，通过排出多种结构不同的物质来对抗抗菌剂，在MDR的发展中起着关键作用[3]，[4]。NorA外排泵由norA基因编码，其表达受关键转录调节因子ArlR的调控，是MRSA中的主要天然MDR外排泵。它显著降低了细菌对氟喹诺酮类、生物杀灭剂、溴化乙锭和小檗碱的敏感性[5]，[6]。NorA外排泵引起的MDR对MRSA的临床预防和治疗提出了重大挑战。因此，arlRmRNA是一个可靠且易于检测的生物标志物，可用于追踪药物外排的动态过程并研究药物作用机制。
RNA检测具有挑战性，因为其在生物流体中的含量低、RNA家族内序列相似度高、调控复杂以及不稳定性强。目前主要的RNA检测方法包括Northern印迹、逆转录定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和微阵列[7]，[8]，[9]。尽管这些传统方法已被广泛采用并常用于RNA分析，但它们也存在一定的局限性。Northern印迹是一种用于早期RNA分析的技术，尽管其稳定性好、可靠性高且假阳性率低，但耗时且劳动强度大，灵敏度较低。此外，当样本中转录本含量低时难以检测到。qRT-PCR在RNA检测方面表现出优异的灵敏度和特异性，但需要昂贵的设备和专业操作人员，复杂的样本准备可能导致污染。微阵列的主要优点是可以同时检测多个目标，但其在临床样本中的应用受到芯片制备成本高、检测设备复杂和需要大量转录本的限制。为了克服传统方法的局限性，近年来开发了几种新的生物传感器和生物测定方法，包括电化学、比色、微流控和光致发光生物测定方法，以及表面等离子共振生物传感器[10]，[11]，[12]，[13]，[14]。这些先进技术在灵敏度和特异性方面显著优于传统方法，降低了假阳性率，缩短了检测时间，并实现了即时检测（POC）。然而，它们也存在一些局限性，如背景信号高、电极耦合和修饰过程复杂，以及需要复杂的纳米材料修饰来提高微通道的亲水性。因此，迫切需要新的灵敏高效的RNA检测方法。
各种DNA纳米器件，如DNA镊子、行走器和马达，为生物传感器的开发开辟了新的途径[15]，[16]。DNA行走器在生物分析领域表现出优异的信号放大和转导特性，因为它们具有高灵活性、高效性、精确性和特异性。典型的DNA行走器通常由三个关键组件组成：驱动力、行走链和行走轨道[17]，[18]。DNA行走器的主要概念是使行走链在预定义的路径上独立且连续地移动，通过诸如链位移反应、酶促反应和光学或化学刺激等驱动力[19]，[20]。此外，它还旨在在整个行走过程中积累和放大检测信号。根据移动腿的数量，DNA行走器可分为单足、双足和多足三种类型[21]，[22]。与前两种类型相比，多足DNA行走器具有更高的稳定性，能移动更长的距离，并且移动速度明显更快。因此，已经开发了许多多足DNA行走器用于检测核酸、癌细胞、端粒酶活性和外泌体[23]，[24]，[25]，[26]。然而，很少有研究利用基于多足DNA行走器的传感平台来检测MRSA，特别是追踪药物外排的动态过程和探索传统中药单体对外排泵的潜在抑制机制。因此，需要开发相关的研究方法。
酶辅助的目标回收技术已被广泛用于检测各种目标，因为它可以提高检测系统的灵敏度[27]，[28]。在传统方法中，目标和探针以1:1的比例混合；然而，这种方法通过酶促水解使目标能够参与多次反应，从而提高目标利用率并增强灵敏度。这意味着只需要极少量的目标就能产生可检测的信号。外切核酸酶III（Exo III）是一种广泛研究的外切核酸酶，无需识别特定的核酸序列即可发挥酶活性[29]，[30]。该酶能够催化双链DNA（dsDNA）3'-末端或凹陷末端的逐个核苷酸的逐步切割。然而，它对单链DNA（ssDNA）或长度超过四个碱基的DNA双链突出末端无效。由于这些独特特性，Exo III辅助的目标回收（EATR）扩增是一种高效的RNA检测方法，可以生成大量扩增拷贝。杂交链反应（HCR）是一种信号放大策略，因其无需酶、操作条件温和、结构多样性和可控的反应动力学而受到广泛关注[31]，[32]。典型的HCR过程需要三个组件：两个DNA发夹和一个DNA启动子。在启动子的存在下，HP1被打开并暴露其粘性片段，该片段与HP2的互补区域杂交。随后，HP2中新暴露的粘性片段（与启动子具有相同的序列）促进HP1的打开。两个DNA发夹之间的级联杂交反应导致形成重复单元的长片段dsDNA，直到HP1或HP2的供应耗尽[33]，[34]。由于这些优势，HCR有潜力发展成为一种强大的信号放大策略，用于设计多种生物传感器。已经独立开发了许多利用EATR或HCR的生物传感器和生物测定方法来检测各种分析物。然而，很少有研究同时利用EATR和HCR在一个系统中检测MRSA并监测其多重耐药性。因此，开发结合EATR和HCR的集成策略对于推进这一领域的研究至关重要。
氧化石墨烯（GO）是一种二维碳纳米材料，由于其优异的物理化学特性，在创新荧光生物分析平台的开发中引起了广泛关注[35]，[36]。GO的广阔表面积有利于通过非共价相互作用和共价结合来结合核酸[37]。此外，GO通常被认为能够淬灭荧光团和荧光生物分子的荧光[38]。因此，我们提出了一种创新的传感方法，结合了Exo III辅助的目标回收、Nb.BbvCI驱动的DNA行走器级联扩增、HCR和荧光叠加效应，在基于GO的荧光生物测定中实现arlRmRNA的超灵敏检测。该生物测定的检测限（LOD）为87 aM，目标可与非目标物质清晰区分。此外，在实际样本中检测目标RNA时，该生物测定表现出优异的性能，与传统方法相比没有显著差异。此外，该生物测定不仅证明了黄芩素可以通过抑制arlR基因表达来调节外排泵活性，还阐明了外排泵和生物膜形成之间的调控相互作用。因此，这种提出的荧光生物测定方法对检测MRSA中的arlR基因转录具有高灵敏度和选择性，具有在临床诊断、环境监测、抗菌剂筛选和药物作用机制研究中的应用潜力。
材料与试剂
链霉亲和素磁珠（MBs）和Exo III（10 U/μL）购自Thermo Fisher Scientific（中国上海）。GO和CGO分散液购自Xianfeng Materials Technology（中国南京）。从NCBI Gene数据库通过BLAST软件进行序列比对，获得了从arlR基因（核苷酸位置301–325）转录的具体目标mRNA序列。本研究中使用的所有寡核苷酸均通过高效液相色谱法纯化。
生物测定的传感机制
图1A展示了NorA外排泵的调控机制示意图，以及黄芩素作为抑制剂靶向arlR基因表达的应用。NorA外排泵受ArlS/ArlR双组分调控系统的控制。该调控机制涉及ArlS的去磷酸化和随后的ArlR磷酸化。磷酸化后，激活的ArlR促进norA基因的转录，从而合成多个NorA
结论
总之，我们提出了一种Nb.BbvCI驱动的多足DNA行走器生物测定方法，通过整合Exo III辅助的目标回收和HCR来监测MRSA中的arlR转录。Exo III和Nb.BbvCI的作用促进了循环I和循环II之间的连接，启动了目标和多足DNA行走器的级联回收。此外，多足DNA行走器显著加速了酶促反应，从而提高了信号放大的效率。
CRediT作者贡献声明
唐可欣：研究、数据分析。陈华英：撰写初稿、数据分析、数据管理。宁毅：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、资金获取、概念构思。徐佳欣：可视化分析、验证
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金[81803964]、[82074250]、湖南省自然科学基金优秀青年项目[2023JJ10031]、长沙优秀创新青年项目[kq2209019]、湖南中医药大学学科建设“揭榜领航”项目[22JBZ031]、湖南中医药大学研究生创新项目（2025CX105）（基础医学）的支持。
