用于增强CRISPR/Cas12a检测效果的酶促crRNA稳定策略

《Talanta》：Enzymatic crRNA Stabilization Strategy for Enhanced CRISPR/Cas12a Detection

CRISPR/Cas12a检测系统通过引入RNase抑制剂增强crRNA稳定性，提升检测灵敏度和抗干扰能力，结合RPA实现结核分枝杆菌临床样本100%特异性、96%灵敏度，为CRISPR诊断优化提供新策略。

　　

白美琪|李月圆|胡倩芳|秦敏|白丽娟

中国重庆医科大学药学院药物工程研究中心，重庆400016

摘要

CRISPR/Cas12a系统通过CRISPR RNA（crRNA）的可编程靶向能力实现精确和快速的核酸识别。然而，crRNA的固有不稳定性限制了基于CRISPR的分子诊断在实际应用中的稳健性和灵敏度。在此，我们提出了一种简单且通用的增强策略，用于抑制RN酶介导的crRNA降解。这种策略被称为RN酶抑制剂（RI）辅助的CRISPR（RI-CRISPR），它利用RI特异性防止crRNA降解，从而提高其稳定性，并增强CRISPR系统的检测性能和抗干扰能力。以甲型流感病毒（IAV）和结核分枝杆菌（MTB）作为模型靶标，RI-CRISPR的检测灵敏度比传统CRISPR/Cas12a提高了近20倍。结合重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的临床验证显示，其特异性达到100%，灵敏度达到96%，与GeneXpert检测方法相当。总体而言，这项工作为提高基于CRISPR的诊断方法的灵敏度和稳健性提供了实用策略，有望促进CRISPR技术的进一步生物医学应用。

引言

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白（Cas）系统是细菌和古菌适应性免疫防御的核心组成部分。Cas蛋白与CRISPR RNA（crRNA）形成的复合物能够特异性识别和切割特定的核酸序列[1]、[2]、[3]、[4]。在各种CRISPR效应蛋白中，Cas12a因其能够处理自身的crRNA并同时介导顺式和反式切割活性而受到广泛关注[5]、[6]、[7]、[8]。作为CRISPR系统中的关键导向分子，crRNA通过沃森-克里克碱基对引导效应蛋白定位到目标序列[9]、[10]。crRNA的结构和稳定性至关重要，因为它们直接决定了CRISPR12a的目标识别准确性、反应灵敏度和信号放大效率，这些都是CRISPR检测系统高效运行的基础[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。因此，合理设计crRNA对于构建高性能和可靠的CRISPR诊断平台至关重要。

尽管crRNA是CRISPR–Cas系统的基础，但在实际应用中面临多个挑战，尤其是在其分子稳定性方面[17]。作为单链RNA分子，crRNA极易被环境中和生物样本中广泛存在的RN酶降解，从而影响分析灵敏度和重复性[18]、[19]。此外，不稳定的crRNA会产生非特异性信号，增加背景噪声[20]。因此，在保持高效目标结合能力的同时增强crRNA稳定性对于提高基于CRISPR的检测系统的性能和适用性至关重要。

研究人员采用了多种化学和结构策略来提高CRISPR诊断中的crRNA稳定性，包括磷硫酰化、2′-O-甲基化、2′-F修饰以及拓扑工程[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。我们团队之前开发了一种基于环状crRNA的CRISPR/Cas12a平台，其闭合环结构可防止外切酶降解，提供强大的核酸酶抗性和操作稳定性[28]。尽管这些化学和结构策略提高了RNA稳定性，但它们往往引入了限制因素，降低了基于CRISPR的系统的检测效率。此外，这些实现方法需要多步骤处理且产率较低，进一步增加了操作复杂性。最近的研究表明，某些化学添加剂可以作为反应增强剂来调节CRISPR的性能[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。值得注意的是，非离子表面活性剂聚维酮（PVP）已被证明可以稳定蛋白质，保持Cas酶的构象和活性，从而提高催化效率和检测灵敏度[35]。受这些发现的启发，我们尝试探索蛋白质添加剂是否也能增强RNA稳定性并进一步优化CRISPR检测性能。

在这项研究中，我们提出了一种名为RI–CRISPR的新策略，通过酶促调节来提高crRNA稳定性，从而增强CRISPR/Cas12a的检测性能。该方法利用RN酶抑制剂（RI）作为特定调控因子，防止RN酶介导的crRNA降解，确保功能性crRNA高效加载到Cas12a上。RI的加入不仅提高了crRNA的稳定性，还促进了系统稳定性和灵敏度的协同提升，实现了精确的目标识别和高信噪比性能。机制研究表明，RI作为一种有效的活性调节因子，对Cas12a的反式切割活性具有积极影响。与传统CRISPR系统相比，RI–CRISPR系统的信号强度提高了约3.2倍，在分析合成双链靶标时检测灵敏度提高了近20倍。此外，将RI–CRISPR与重组酶聚合酶扩增（RPA）结合使用，实现了对40个结核分枝杆菌临床样本的高灵敏度和特异性鉴定，为下一代基于CRISPR的分子诊断提供了一种简单而稳健的策略。

实验部分片段

CRISPR/Cas12a反式切割检测

简而言之，20 μL的反应体系包含10 nM Cas12a、10 nM crRNA、不同浓度的RI、500 nM FQ报告基因、1× NEBuffer 2.1和2 μL DNA靶标。荧光信号由CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国）在37°C下记录60分钟，数据点每分钟采集一次。同样，也在不添加RI的20 μL反应体系中进行了传统的CRISPR/Cas12a检测。荧光强度的测量方法如下：

RI增强CRISPR/Cas12a的活性

RI–CRISPR系统的整体工作流程如图1A所示。该系统包括Cas12a、crRNA、RN酶抑制剂（RI）、荧光团-淬灭剂（FQ）报告基因和目标DNA。当识别到目标序列时，Cas12a被激活并对FQ报告基因进行反式切割，产生增强的荧光信号。为了验证酶控crRNA稳定性对CRISPR/Cas12a检测性能的提升作用，我们合成了IAV-crRNA

结论

在这项研究中，我们开发了一种酶促crRNA稳定策略，以增强CRISPR/Cas12a的检测性能。通过引入特定的RN酶抑制剂来保护CRISPR系统组分的稳定性，该方法显著提高了检测系统的稳健性和灵敏度。在此基础上，我们开发了一种结合RPA和RI-CRISPR系统的集成检测方法，并成功应用于临床中结核分枝杆菌的高灵敏度和特异性检测

CRediT作者贡献声明

李月圆：验证、软件、方法学。白美琪：撰写——原始草案、可视化、软件、方法学、研究、数据分析、概念化。秦敏：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取。胡倩芳：验证、项目管理。白丽娟：监督、项目管理、资金获取、数据管理

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82072378、22504009）、重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCQ-LZX0126、CSTB2025NSCQ-GPX0375）、中国重庆人才：杰出青年人才项目（CQYC202005015、cstc2021ycjh-bgzxm0328）的支持。