《Synthetic and Systems Biotechnology》：Advances in vehicles for in situ delivery: From classical vectors to biologically inspired structures
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本综述系统评述了蛋白质和核酸递送工具的前沿进展，覆盖病毒载体（LV、AdV、AAV）、非病毒载体（LNP、PEI、VLP、外泌体、CPP、AuNP、MSN）及新兴生物启发系统（Arc、PNMA2、SEND、PVC、凝聚层系统），剖析其作用机制、应用进展与优劣，为合成生物学与基因治疗的技术发展与理论研究提供系统参考。
随着合成生物学和基因治疗领域的兴起，高效、特异地将蛋白质和核酸递送至靶细胞成为实现基因层面干预与重编程的核心挑战。为此，开发具有高特异性、强可制造性和低免疫原性的递送工具，是推动这些领域持续进步的关键驱动力。本文对蛋白质和核酸递送系统的近期进展进行了全面总结。
2. 基于病毒的递送系统
病毒载体是基因治疗的奠基性递送平台，利用其进化优化的细胞进入、基因组保护和高效转基因表达机制。尽管腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）和慢病毒（LV）载体在复制策略和载货能力上存在差异，但它们共享可预测的趋向性、高递送效率以及广泛的工程灵活性等特性，这些特性使其能够改善安全性和效力。结合成熟的生产系统，病毒载体持续作为支持体内和体外治疗应用的核心技术。
2.1. 腺病毒：具有免疫原性限制的高容量基因递送主力
腺病毒载体（AdVs）由无包膜的二十面体衣壳（80–100 nm）包裹线性双链DNA基因组（26–45 kb）构成。腺病毒在20世纪50年代被鉴定为感染上皮细胞而不整合入宿主基因组的呼吸道病原体，随后因其高转导效率、大载货容量以及保持附加体状态等优势而被开发为有前景的、经过临床验证的基因递送工具。在载货能力方面，删除对病毒繁殖非必需的E3结构域后，AdVs可容纳长达37 kb的转基因。在辅助依赖型（“无内脏”）变体中，载货容量可扩展至约37 kb。由于其靶向递送范围广泛，AdVs可在多种不同场景中广泛应用。临床上，AdVs已成功用于疫苗（如COVID-19疫苗Ad26.COV2.S）和溶瘤疗法（如DNX-2401）。然而，所有AdV蛋白均表现出高免疫原性。因此，对AdV蛋白的预存免疫和急性炎症反应限制了AdVs的重复给药及其长期有效性。尽管AdV因其固有的安全性和性能限制，在很大程度上已被AAV、LNP和LV系统所取代，但它们仍将在利用其强转导效率、大载货容量和特征明确的生物学特性的应用中发挥重要作用，特别是在疫苗平台和癌症免疫治疗的短期基因递送中。
2.2. AAV：具有发展前景的临床成熟病毒载体
腺相关病毒（AAV）是一种临床成熟的基因递送载体，具有无包膜的二十面体衣壳（约25 nm），包裹着两侧带有反向末端重复序列（ITR）的单链DNA基因组（约4.7 kb）。AAV衣壳由三种结构蛋白（VP1:VP2:VP3，比例为1:1:10）组成，这些蛋白暴露在衣壳表面决定组织趋向性。目前已有超过100种具有不同组织趋向性的天然AAV血清型被鉴定。此外，通过衣壳蛋白的定向进化获得的工程化变体也扩展了AAV的靶向能力。AAV在肌肉、视网膜和中枢神经系统等有丝分裂后组织中表现出出色的转导效率，能够在非分裂细胞中实现长期稳定的基因表达。临床上，已有数种AAV疗法获得美国FDA批准。在眼科，voretigene neparvovec是首个获批用于治疗由RPE65突变引起的莱伯先天性黑蒙（LCA）的AAV疗法。尽管如此，AAV可包装的外源基因片段上限约为4.5 kb，且30-60%的人群存在预存中和抗体（NAbs），这限制了AAV的重复给药。近年来，该领域的发展集中在通过双载体反式剪接系统克服有效载荷限制、通过结构引导的衣壳工程实现中枢神经系统穿透（例如，可穿越血脑屏障的AAV-PHP.eB），以及将AAV与脂质纳米颗粒结合以逃避免疫清除等混合设计上。AAV目前仍是应用最广泛的病毒载体，很可能继续在靶向小尺寸基因的体内基因治疗中占主导地位。
2.3. 慢病毒载体：用于持久基因表达的整合平台及其挑战
慢病毒载体（LVs）主要源自HIV-1，其特征为包膜结构，包裹单链RNA基因组（约8-9 kb），该基因组可逆转录为具有整合能力的DNA。LVs通常包含一组最少的衣壳蛋白、假型包膜糖蛋白（通常是VSV-G）、高达9 kb的载货容量、作为必需顺式作用元件的LTR以及用于病毒组装的ψ包装信号。独特的是，LVs可以通过受体介导的内吞作用高效转导分裂和非分裂细胞，实现稳定的基因组整合。临床上，已有几种LV疗法获得美国FDA批准。尽管如此，LV的体内应用仍面临先天免疫识别（通过TLR介导的途径）和在肝脏、脾脏中意外蓄积等重大挑战。LV的靶向潜力可以通过包膜工程进一步增强。持续的瓶颈包括受贴壁生产平台低产量限制的制造可扩展性，以及确保全身给药期间的载体稳定性。LVs将继续是CAR-T和其他自体细胞疗法的主导平台，但其角色正在转变。与其作为广泛的基因递送工具，它们越来越被定位为持久的体外细胞重编程的专用工具，而下一代体内基因疗法将可能由非整合或非病毒递送方式驱动。
3. 基因治疗中的非病毒递送系统
非病毒递送系统已成为基因治疗中多功能且日益得到临床验证的工具，与传统病毒载体相比，提供了改进的安全性、可扩展的制造和广泛的载货兼容性。这些系统能够有效封装、保护核酸、蛋白质和基因组编辑货物并进行细胞内递送。在机制上，它们通过内吞作用或膜相互作用介导细胞进入，随后通过脂质融合或直接膜失稳实现内体逃逸和胞质货物释放。化学设计、模块化工程和靶向表面功能化的快速发展继续扩大非病毒载体的治疗前景。
3.1. 脂质纳米粒（LNPs）作为体外基因治疗的载体
脂质纳米粒（LNPs）是非病毒递送系统，其分子结构特征为由四种核心成分组成的100 nm囊泡结构：可电离阳离子脂质、胆固醇、辅助磷脂（DSPC或DOPE）和聚乙二醇化脂质。这种分子结构能够有效封装和保护多种核酸有效载荷，包括mRNA和siRNA，在全身循环中保护它们免受酶降解。功能上，LNPs通过受体介导的内吞作用进入细胞；一旦处于酸性内体环境（pH < 6.0）中，LNPs内的可电离脂质质子化，促进膜融合和内体逃逸，最终促进治疗货物的胞质释放。LNPs表现出显著优势，包括良好的生物相容性、可调节的理化性质、高核酸负载能力以及对酶降解的有效保护。这些特点支撑了COVID-19 mRNA疫苗的临床成功。在肿瘤学中，LNPs促进了化疗药物的靶向递送、用于CAR-T细胞治疗的肿瘤特异性抗原（例如，用VHH抗体标记肿瘤）以及免疫调节剂（如PD-L1抑制剂）的递送，将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。LNPs还能够实现CRISPR-Cas成分的高效全身递送，用于临床前模型中的基因校正。然而，LNPs存在一些固有限制。主要挑战包括其低内体逃逸效率、与PEG相关的免疫原性、有限的体内稳定性和可扩展性，这些问题持续制约着LNP系统的更广泛治疗应用。LNP的肝向性是通过载脂蛋白E（ApoE）介导的摄取导致未修饰的LNPs在肝脏中积累引起的。为应对这一主要问题，已开发出选择性器官靶向（SORT）修饰，使LNPs能够重新分布到肝脏以外的器官，包括肺、脾脏和淋巴结。
3.2. 聚乙烯亚胺：用于更安全、靶向递送的经典合成聚复合物系统
聚乙烯亚胺（PEI）是一种合成的阳离子聚合物，能够通过静电相互作用与带负电的核酸形成稳定的聚复合物，使其成为一种有用的非病毒基因递送载体。在结构上，PEI以线性和支链形式存在，其中支链25 kDa变体因其致密的阳离子电荷密度而特别有效，能促进与DNA、RNA和质粒的强结合。PEI通过多种协同机制实现内体逃逸。PEI介导的转染依赖于对细胞膜的静电吸附、主要通过网格蛋白介导途径的内吞摄取，而“质子海绵效应”是内体逃逸的核心机制。在体外应用中，PEI的转染效率通常在多种细胞系和组织中很高，并且表现出高效的核酸压缩和保护能力。然而，在体内应用中，PEI基因递送载体的性能受到血清抑制、不稳定性以及高细胞毒性（由其强正表面电荷引起）的阻碍。此外，PEI缺乏固有的靶向特异性，导致在肝脏和肺等器官中的非特异性积累。为了解决这些挑战，当前研究集中在通过结构修饰来增强PEI基因递送载体的安全性和有效性。与靶向配体（例如肽）或针对RGD基序的抗体进行化学偶联可实现细胞选择性摄取。聚乙二醇化已被证明可以降低免疫原性并延长循环时间，而掺入可生物降解的连接键（例如酯键）有助于减轻长期毒性。聚乙烯亚胺（PEI）将继续是体外转染和局部核酸递送的主力，然而，其固有的不可生物降解性从根本上限制了其作为安全、临床可行的全身体内基因治疗平台的适用性。
3.3. 病毒样颗粒（VLPs）：连接合成与生物递送平台的病毒启发纳米载体
病毒样颗粒（VLPs）构成一种“病毒衍生的非病毒系统”，由病毒结构蛋白自组装而成，但缺乏病毒遗传物质；因此，VLPs结合了病毒的递送效率和增强的生物安全性。在结构上，VLPs分为有包膜和无包膜两类，其结构由亲本病毒的衣壳蛋白决定。虽然有包膜和无包膜的VLPs在实现胞质释放的机制上存在差异，但它们都促进了核糖核蛋白（RNPs）形式的基因编辑复合物的封装和递送。此外，VLP平台的细胞和组织选择性可以通过明智地选择掺入衣壳壳的病毒蛋白来调节，从而利用已知病毒的多样性及其独特的趋向性。通过利用天然的病毒进入机制，VLPs通常实现与感染性病毒相当的递送效率。当前VLP的应用范围广泛，涵盖预防性和治疗性疫苗开发、靶向癌症治疗以及基因编辑疗法的递送。尽管VLPs具有许多优点，但在系统性基因治疗中更广泛的使用仍面临重大挑战。它们通常会引发强烈的先天性和适应性免疫反应，这可能损害重复给药并缩短循环时间。因此，VLPs不太可能取代工程化病毒载体用于长期基因递送或需要重复全身给药的适应症。相反，它们最有可能继续在免疫原性、多价展示和精确抗原呈递至关重要的领域占据主导地位。为克服VLP的固有限制，持续的努力集中在优化表达系统和应用表面工程策略，例如聚乙二醇化，以增强药代动力学行为并最小化免疫识别。如上所述，VLP的靶向特异性主要由掺入衣壳壳的病毒蛋白决定。通过采用工程方法，如假型化（使用异源包膜蛋白如VSV-G以扩大趋向性）和重新设计表面糖蛋白，研究人员旨在实现精确和可控的细胞类型靶向。
3.4. 外泌体（细胞外囊泡）：用于临床级靶向递送的内源性囊泡系统
外泌体是天然分泌的、源自多种细胞类型的细胞外囊泡（直径30-150 nm）。由于其固有的生物相容性、低免疫原性、天然靶向能力以及跨越生物屏障（包括血脑屏障）的能力，外泌体已成为一种有吸引力的药物递送系统。功能上，这些脂质双层包裹的纳米囊泡可以装载一系列生物活性货物，包括蛋白质、脂质和核酸。临床上，基于外泌体的疗法进展迅速，在多个领域取得显著进展，包括肿瘤学、神经病学和免疫治疗。由于外泌体的表面膜蛋白来源于亲代细胞，大多数天然外泌体也表现出组织趋向性。这种趋向性可以通过表面工程方法进一步增强，包括抗体偶联或病毒糖蛋白假型化。尽管外泌体具有相当大的优势，但在其分离和纯化、产量限制以及异质性方面仍存在挑战。此外，相当一部分外泌体被单核吞噬细胞系统清除。为应对这一限制，已采用聚乙二醇化和CD47信号掺入等策略来延长全身循环。尽管如此，最近的几项进展凸显了外泌体的转化潜力：可吸入的基于外泌体的SARS-CoV-2疫苗已被证明可诱导黏膜免疫；干细胞来源的外泌体在心肌梗死的临床前模型中显示出再生功效。这些发现共同支持了外泌体在多种治疗领域的广泛实用性。
3.5. 细胞穿透肽：基本机制与不断扩大的治疗应用
细胞穿透肽（CPPs）是短肽片段（通常为10-30个氨基酸），具有阳离子或两亲性，使其能够穿过细胞膜并递送多种分子货物。自1988年发现HIV-1 Tat肽以来，代表性的CPPs（包括Tat、penetratin、transportan和聚精氨酸）已被广泛用于核酸、蛋白质、纳米颗粒和小分子的非病毒递送载体。CPPs通过直接膜转位和内吞作用被内化，并且可以与货物化学偶联或非共价复合。最近，CPPs被重新用作CRISPR/Cas9核糖核蛋白的非病毒递送平台。临床上，CPPs已作为抗癌剂和肿瘤靶向有效载荷载体进入临床研究。虽然除了p28之外的临床转化仍然有限，但扩展的临床前项目利用CPPs递送化疗药物、蛋白质治疗剂、成像剂和寡核苷酸。在开发中枢神经系统治疗剂的研究中，CPP融合物在动物中风模型中显示出高神经保护活性，并且它们也被探索为神经营养因子和其他生物制剂的载体。然而，CPP货物的胞质生物利用度常常因内体滞留而降低，除非专门设计内体逃逸，否则会削弱功能活性。此外，蛋白水解不稳定性和快速的肾脏清除会限制全身暴露，需要化学修饰来提高血清稳定性。然而，这些修饰可能以降低摄取或增加毒性为代价。此外，脱靶摄取和缺乏细胞类型特异性可能给全身应用带来安全和剂量挑战；事实上，一些研究已经观察到免疫原性和意外毒性，使临床开发复杂化。最后，基于肽的递送系统的可扩展制造、可重复配方和监管途径仍然是必须解决的实际障碍。细胞穿透肽（CPPs）将继续作为研究环境和局部治疗应用中细胞内递送的灵活工具。它们跨细胞膜的能力使其对机制研究和模块化设计具有吸引力。然而，它们在系统性体内基因或蛋白质递送中的使用仍然困难。CPPs在生物体液中迅速降解，显示出有限的组织选择性，并从循环中快速清除。这些特征降低了其有效剂量并增加了脱靶摄取的风险。此外，几种CPPs表现出剂量相关的细胞毒性，这进一步限制了它们的临床潜力。因此，CPPs更适合于与其他递送系统互补的协作工作流程，而不是作为广泛临床转化的独立平台。
3.6. 金纳米粒子（AuNPs）：用于基因治疗的结构可调无机载体
金纳米粒子（AuNPs）是球形无机颗粒（通常尺寸为5-50 nm），因其有利的物理化学性质、固有的生物相容性和异常可调的表面化学而受到重视。金核为强大的硫-金化学提供了稳健的平台，能够共价连接寡核苷酸、肽、蛋白质和小分子；允许构建多功能偶联物，包括球形核酸和Cas9核糖核蛋白载体。迄今为止，AuNPs已被用于递送广泛的治疗货物，从siRNA和mRNA到CRISPR–Cas9核糖核蛋白和小分子药物；此外，当AuNPs与内体破坏性聚合物或阳离子涂层配制时，已在体外和体内证明了这些货物的功能性递送。用聚乙二醇（或相关亲水聚合物）对AuNPs进行表面功能化可显著提高在生物体液中的胶体稳定性，减少血清蛋白和调理素的吸附，并延长全身循环；然而，聚乙二醇化也会改变细胞摄取，必须针对每个应用进行优化。利用这些特性，原理验证系统（如CRISPR-Gold，其中用硫醇化DNA涂覆的15 nm金核与Cas9 RNP和内体破坏性聚合物复合）已在小鼠模型中实现体内同源定向修复和疾病突变的功能性矫正，展示了AuNP平台用于基因编辑和核酸治疗的转化潜力。AuNP递送效率高度依赖于尺寸，15-20 nm范围内的颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用表现出最佳的细胞摄取。靶向特异性可以通过掺入各种表面配体来控制：叶酸能够选择性递送至FRα阳性肿瘤；RGD肽靶向ανβ3整合素；抗体偶联物提供疾病特异性识别。值得注意的是，叶酸偶联的AuNPs已被开发为有效的靶向纳米平台用于癌症治疗，并且与未靶向系统相比，在叶酸受体阳性肿瘤中显示出增强的细胞摄取和更优的治疗效果。一项针对复发性胶质母细胞瘤的基于RNA干扰的球形核酸（NU-0129）的0期临床研究首次提供了基于AuNP的基因治疗药物的临床安全性和肿瘤特异性递送证据，凸显了其转化潜力。除了癌症治疗，AuNP基系统也已应用于神经系统疾病。例如，基于AuNP的CRISPR递送至脆性X综合征小鼠模型大脑挽救了小鼠的夸张重复行为，证明AuNP介导的基因编辑可以在体内实现功能性神经恢复。尽管取得了这些进展，AuNPs在系统性基因或蛋白质递送的广泛临床转化方面仍面临明显障碍。它们的生物分布偏向肝脏和脾脏积累，这限制了对许多靶器官的递送，并引起了长期积累和毒性的担忧。AuNPs的内体滞留仍然是一个障碍。像通过
