Levistolide A 通过 ATF6 诱导三阴性乳腺癌中的内质网应激引发的细胞凋亡

《Toxicology and Applied Pharmacology》：Levistolide A induces endoplasmic reticulum stress-triggered apoptosis via ATF6 in triple-negative breast cancer

三阴性乳腺癌中Ligusticum chuanxiong提取物LA通过激活内质网应激抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡，实验发现LA显著抑制TNBC细胞增殖并触发ER应激，加入ER应激抑制剂褪黑素可逆转LA的抗增殖和促凋亡效应，同时验证了LA在体内外的抗肿瘤活性。

　　

白一田|王丹丹|关汉天|郭洋洋|朱恒月|陈周云

浙江省严重肝胰疾病诊疗重点实验室，温州医科大学第一附属医院，中国温州325000

摘要

背景

Levistolide A（LA）是从中药植物川芎中提取的一种生物活性成分，具有抗癌特性。然而，其在三阴性乳腺癌（TNBC）中的功能及其作用机制尚未得到充分研究。

方法

我们通过在不同浓度下处理体外模型，评估了LA对TNBC细胞内质网（ER）应激的影响。利用CCK-8检测、菌落形成实验和免疫荧光显微镜观察细胞活力和增殖情况。随后，将肿瘤细胞与ER应激抑制剂褪黑素共孵育，并通过流式细胞术量化细胞凋亡的变化。通过Western blotting和定量逆转录PCR技术在蛋白质和转录水平上分析了ER应激相关标志物的表达模式。这些体外观察结果在肿瘤异种移植模型中得到了进一步验证，从而证实了ER应激对LA抗肿瘤活性的贡献。

结果

实验结果表明，LA显著抑制TNBC细胞的增殖，诱导ER应激并促进细胞凋亡。当给予褪黑素以阻断ER应激时，LA抑制TNBC细胞增殖和诱导凋亡的能力显著恢复。

结论

我们的发现表明，LA通过激活ER应激来抑制TNBC的进展。这一发现为临床开发针对TNBC的创新治疗策略提供了新的方向。

引言

乳腺癌是一种全球范围内普遍存在的恶性肿瘤，在女性患者中的发病率仅次于肺癌。尽管早期检测和治疗的进步降低了死亡率，但乳腺癌仍然是女性癌症相关死亡的第二大原因（Giaquinto等人，2024年）。雌激素受体、人表皮生长因子受体2（HER2）和孕酮受体（PR）是三种常用的生物标志物，根据它们的表达谱将乳腺癌患者分为TNBC和非TNBC亚型（Derakhshan和Reis-Filho，2022年）。由于TNBC中缺乏这些生物标志物的表达，靶向治疗和内分泌疗法的效果有限（Lev，2020年；Roskoski Jr.，2024年；Santiago-Gómez等人，2019年）。因此，TNBC被认为是一种预后较差的乳腺癌亚型（Li等人，2022年）。化疗已成为TNBC的主要治疗方法，但化疗药物的副作用以及TNBC患者对药物的耐药性问题仍未得到解决（Roskoski Jr.，2024年）。因此，开发针对TNBC的新药策略显得尤为紧迫。

在TNBC的发病机制中，肿瘤微环境中同时存在细胞内和细胞外的应激途径。这些应激机制改变了肿瘤环境，削弱了抗肿瘤免疫反应，促进了恶性肿瘤的进展（Eckerling等人，2021年）。其中，ER应激已被证明可以通过触发未折叠蛋白反应（UPR）途径来抑制癌症进展（Chen和Cubillos-Ruiz，2021年）。内质网作为蛋白质成熟和运输的主要细胞内场所，在维持细胞稳态中起着关键作用。UPR是一种由内质网腔内错误折叠蛋白质过度聚集引发的应激适应机制（Sisinni等人，2019年）。研究表明，在肿瘤发展过程中，癌细胞和浸润的免疫细胞中的ER功能都会受损，导致异常蛋白质的逐渐积累。当这种积累超过临界阈值时，三个关键的ER膜传感器会启动UPR，进而激活多个下游信号通路（Xu等人，2022年）。值得注意的是，ER应激对肿瘤的影响具有双重性：轻度ER应激促进癌细胞增殖、转移和侵袭，而重度ER应激则抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡（Yang等人，2024年）。因此，针对ER应激是一种非常有前景的癌症治疗策略。

川芎是一种传统中药，长期以来被用于癌症治疗，既可以单独使用，也可以与其他药物联合使用（Zhao等人，2025年）。从这种植物中提取的生物活性化合物LA在中国已被用于抗肿瘤制剂中（Ding等人，2019年）。Ming Qian等人的研究表明，LA能有效对抗乳腺癌细胞中的P-糖蛋白介导的药物耐药性（Chen等人，2008年），这支持了LA治疗TNBC的潜力。Shaochin Lee及其同事提供了额外证据，表明LA通过涉及活性氧（ROS）介导的ER应激途径诱导结肠癌细胞凋亡（Yang等人，2017年）。然而，LA是否能够治疗TNBC及其作用机制仍不清楚。

在这项研究中，我们首先使用CCK-8和菌落形成实验评估了LA对TNBC细胞增殖的抑制作用，并利用流式细胞术研究了其对细胞凋亡的影响。随后，通过分子对接方法探讨了其抗TNBC机制。此外，还利用皮下肿瘤动物模型验证了其在体内的疗效和作用机制。结果表明，LA通过上调ER应激相关蛋白的表达来有效调节TNBC的进展。这项研究为治疗TNBC提供了一种潜在的新策略。

实验部分

细胞培养

人TNBC细胞系MDA-MB-231和BT-549来自上海细胞生物学研究所的细胞库，所有细胞系均在添加了10% FBS的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37°C、5% CO?的湿润培养箱。使用Trypsin-EDTA（Gibco）将细胞从培养板上分离，并每两天传代一次。

CCK-8

TNBC细胞以3 × 10³细胞/孔的密度接种到96孔培养板上，并与不同浓度的LA共同孵育24小时。

LA抑制TNBC细胞的增殖

LA的化学结构如图1A所示。我们通过在不同浓度下处理MDA-MB-231和BT-549细胞培养物，探索了LA对TNBC细胞生长的药理效应。为了评估细胞活力，使用了CCK-8检测方法，MDA-MB-231细胞的IC50值为86.36 ± 0.13 μM，BT-549细胞的IC50值为89.64 ± 0.21 μM，数据如图1B和C所示。为了验证LA的安全性和细胞毒性，我们进行了同样的实验。

讨论

全球范围内，乳腺癌仍然是影响女性的主要恶性肿瘤，其发病率和死亡率持续上升（Siegel等人，2024年；Sung等人，2021年）。最具侵袭性的乳腺癌亚型是TNBC，其特征是疾病发作早、内脏转移频繁以及复发率快，这些因素共同导致了不良的临床结局（Duffy等人，2012年；Zhu等人，2021年）。目前，雌激素受体、PR和HER2是用于根据表达谱将乳腺癌患者分为TNBC和非TNBC亚型的三种常见生物标志物（Derakhshan和Reis-Filho，2022年）。由于TNBC中缺乏这些生物标志物的表达，靶向治疗和内分泌疗法的效果有限（Lev，2020年；Roskoski Jr.，2024年；Santiago-Gómez等人，2019年）。因此，TNBC被认为是一种预后较差的乳腺癌亚型（Li等人，2022年）。化疗已成为TNBC的主要治疗方法，但化疗药物的副作用以及TNBC患者对药物产生耐药性的问题仍未解决（Roskoski Jr.，2024年）。因此，开发针对TNBC的新药策略迫在眉睫。

在TNBC的发病机制中，肿瘤微环境中同时存在细胞内和细胞外的应激途径。这些应激机制改变了肿瘤环境，削弱了抗肿瘤免疫反应，促进了恶性肿瘤的进展（Eckerling等人，2021年）。在这些途径中，ER应激已被证明可以通过触发未折叠蛋白反应（UPR）途径来抑制癌症进展（Chen和Cubillos-Ruiz，2021年）。内质网作为蛋白质成熟和运输的主要细胞内场所，在维持细胞稳态中起着关键作用。UPR是一种由内质网腔内错误折叠蛋白质过度聚集引发的应激适应机制（Sisinni等人，2019年）。研究表明，在肿瘤发展过程中，癌细胞和浸润的免疫细胞的ER功能都会受损，导致异常蛋白质的逐渐积累。当这种积累超过临界阈值时，三个关键的ER膜传感器会启动UPR，从而激活多个下游信号通路（Xu等人，2022年）。值得注意的是，ER应激对肿瘤的影响具有双重性：轻度ER应激促进癌细胞增殖、转移和侵袭，而重度ER应激则抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡（Yang等人，2024年）。因此，针对ER应激是一种非常有前景的癌症治疗策略。

川芎这种传统中药长期以来被用于癌症治疗，既可以单独使用，也可以与其他药物联合使用（Zhao等人，2025年）。从这种植物中提取的生物活性化合物LA在中国已被用于抗肿瘤制剂中（Ding等人，2019年）。Ming Qian等人的研究表明，LA能有效对抗乳腺癌细胞中的P-糖蛋白介导的药物耐药性（Chen等人，2008年），这支持了LA治疗TNBC的潜力。Shaochin Lee及其同事提供了额外证据，表明LA通过涉及活性氧（ROS）介导的ER应激途径诱导结肠癌细胞凋亡（Yang等人，2017年）。然而，LA是否能够治疗TNBC及其作用机制仍不清楚。

在这项研究中，我们首先使用CCK-8和菌落形成实验评估了LA对TNBC细胞增殖的抑制作用，并利用流式细胞术研究了其对细胞凋亡的影响。随后，通过分子对接方法探讨了其抗TNBC机制。此外，还利用皮下肿瘤动物模型验证了其在体内的疗效和作用机制。结果表明，LA通过上调ER应激相关蛋白的表达来有效调节TNBC的进展。这项研究为治疗TNBC提供了一种潜在的新策略。

实验片段

细胞培养

人TNBC细胞系MDA-MB-231和BT-549来自上海细胞生物学研究所的细胞库，所有细胞系均在添加了10% FBS的RPMI-1640培养基中培养，培养条件为37°C、5% CO?的湿润培养箱。使用Trypsin-EDTA（Gibco）将细胞从培养板上分离，并每两天传代一次。

CCK-8

TNBC细胞以3 × 10³细胞/孔的密度接种到96孔培养板上，并与不同浓度的LA共同孵育24小时。

LA抑制TNBC细胞的增殖

LA的化学结构如图1A所示。我们通过在不同浓度下处理MDA-MB-231和BT-549细胞培养物24小时，探讨了LA对TNBC细胞生长的药理效应。为了评估细胞活力，使用了CCK-8检测方法，MDA-MB-231细胞的IC50值为86.36 ± 0.13 μM，BT-549细胞的IC50值为89.64 ± 0.21 μM，数据如图1B和C所示。为了验证LA的安全性和细胞毒性，我们进行了相同的实验。

讨论

全球范围内，乳腺癌仍然是影响女性的主要恶性肿瘤，其发病率和死亡率持续上升（Siegel等人，2024年；Sung等人，2021年）。最具侵袭性的乳腺癌亚型是TNBC，其特征是疾病发作早、内脏转移频繁以及复发率快，这些因素共同导致了不良的临床结局（Duffy等人，2012年；Zhu等人，2021年）。目前，雌激素受体、PR和HER2是用于分类TNBC和非TNBC亚型的主要生物标志物。

结论

总之，本研究表明，LA通过诱导ER应激表现出显著的抗肿瘤活性。基于此，LA是一种有潜力用于对抗TNBC的药物候选物。

作者贡献声明

白一田：撰写——原始草稿、验证、方法学、数据分析。王丹丹：方法学、数据分析。关汉天：撰写——审稿与编辑、监督。郭洋洋：撰写——审稿与编辑、方法学、实验设计。朱恒月：撰写——审稿与编辑、方法学。陈周云：撰写——审稿与编辑、监督。

资助

本研究由温州市科学技术局基金会资助（Y2023222）。

利益冲突声明

作者声明本研究是在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

我们感谢所有参与或协助这项研究项目的人员。