《Nature Communications》：Biosynthesis of pyomelanin from methanol with engineered Komagataella phaffii and its characterizations
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本研究针对天然生产者中吡奥黑色素产量低的瓶颈，通过工程改造毕赤酵母（Komagataella phaffii），构建了高效的吡奥黑色素生物合成平台。研究人员通过平衡3个生物合成模块，将前体高龙胆酸（HGA）产量提高了66倍，并建立了吡奥黑色素颜色筛选系统，用于关键酶（如AroG和HppD）的定向进化与半理性设计。研究揭示了碱性氧化聚合与漆酶（laccase）处理对产物差异的影响，在5-L发酵罐中经过204小时高密度发酵，工程菌株Pyo29产量达到70.5±0.7 g/L，为吡奥黑色素的高产及工业化应用提供了可行方案。
在材料科学、生物医学和环境工程等多个前沿领域，吡奥黑色素（pyomelanin）因其独特的光学、电学和抗氧化性能而备受瞩目。然而，从天然生产者中分离这种“黑金”的效率却极低，产量成为其迈向大规模商业化应用道路上的首要障碍。这种供不应求的局面，促使科学家们将目光转向合成生物学，希望通过工程改造微生物，使其成为可持续、经济可行的“细胞工厂”，实现吡奥黑色素的高效、绿色制造。本研究正是为了解决这一核心问题，探索了利用工程化毕赤酵母（Komagataella phaffii）从廉价底物甲醇出发，构建高效吡奥黑色素合成路径的可行性与潜力。
为了深入探索这一科学问题，研究人员开展了一项系统性研究。他们首先对毕赤酵母的代谢网络进行理性设计，通过精细平衡三个独立的生物合成模块，成功将关键前体高龙胆酸（HGA）的产量提升了惊人的66倍。在此基础上，他们建立了一个基于颜色的高通量筛选系统，巧妙地应用于对3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（AroG）的定向进化，以及对4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（HppD）进行半理性设计改造，从而优化了整个合成通路。研究还比较了在碱性条件下的化学氧化聚合与利用漆酶（laccase）催化的酶法聚合，在产物性质上产生的差异。最终，在5升发酵罐中进行的高密度发酵实验中，最佳工程菌株Pyo-29经过204小时的培养，实现了70.5±0.7克/升的吡奥黑色素产量，并进一步表征了其应用潜力。这项研究成果已发表于《自然·通讯》（Nature Communications）杂志。
本研究运用了多项关键实验技术，主要包括：1. 代谢工程与合成生物学策略，用于重构和优化毕赤酵母中的吡奥黑色素生物合成途径；2. 建立基于颜色的表型筛选系统，用于高通量筛选高产菌株及进化关键酶；3. 酶工程的定向进化与半理性设计，用于改造AroG和HppD等限速酶；4. 微生物高密度发酵技术，在5升生物反应器中放大培养工程菌株以评估其生产性能。
结果
通过模块化工程和代谢平衡显著提高HGA产量
研究人员对毕赤酵母的代谢途径进行了系统性改造。通过引入并平衡三个关键生物合成模块——芳香族氨基酸合成模块、酪氨酸羟基化模块以及HGA合成模块，他们成功构建了一系列工程菌株。其中，菌株HGA-15的HGA产量达到4.5克/升，相较于出发菌株提高了66倍。这一结果为后续吡奥黑色素的合成积累了充足的前体。
建立吡奥黑色素颜色筛选系统并用于关键酶进化
为了便于筛选高产菌株，研究团队建立了一个基于吡奥黑色素颜色深浅的高通量可视化筛选系统。利用该系统，他们对负责芳香族氨基酸合成途径第一步的关键酶AroG进行了定向进化，获得了一个突变体AroGI97L，其酶活提高了1.8倍。同时，他们对负责HGA合成的关键酶HppD进行了半理性设计，将第230位的天冬氨酸突变为丙氨酸（D230A），显著提升了酶活。这些改造进一步强化了合成通路。
不同聚合方式对吡奥黑色素性质的影响
研究比较了两种将HGA聚合为吡奥黑色素的方法：在碱性条件下的自发氧化聚合，以及利用漆酶催化的酶促聚合。光谱学和元素分析表明，两种方法得到的产物在化学结构和元素组成上存在差异，例如漆酶聚合产物的碳/氮比更高。这提示不同的生产方式可能得到性质略有不同的材料，为定制化生产提供了可能。
高密度发酵实现吡奥黑色素的高产
将最优的工程菌株Pyo-29在5升发酵罐中进行高密度补料分批培养。通过以甲醇为碳源进行长期发酵（204小时），菌株生物量达到极高的水平，并最终实现了70.5±0.7克/升的吡奥黑色素产量，生产强度达到0.346克/升/小时。这证明了该工艺具有工业化放大生产的潜力。
吡奥黑色素的应用潜能表征
最后，研究人员对生物合成的吡奥黑色素进行了初步应用评估。实验表明，该材料表现出良好的自由基清除能力、紫外屏蔽性能以及染料吸附能力，展示了其在抗氧化剂、防晒材料和废水处理等领域的潜在应用价值。
结论与讨论
本研究成功构建了一个高效的微生物细胞工厂，利用工程化的毕赤酵母以甲醇为底物，实现了吡奥黑色素的高产量生物合成。通过多模块代谢平衡、关键酶定向进化与半理性设计，以及高密度发酵工艺的优化，最终产量达到了创纪录的70.5克/升。这项工作不仅首次报道了在毕赤酵母中从头合成吡奥黑色素，更重要的是，它为解决天然黑色素产量低、提取难的问题提供了一个极具竞争力的合成生物学解决方案。研究所建立的颜色筛选系统为相关代谢物的高产菌株选育提供了通用工具。最后，对产物应用潜能的初步探索，为这种生物基黑色素的商业化开发指明了方向。该研究打通了从廉价原料到高价值产品的生物制造通路，为吡奥黑色素及相关芳香族化合物的大规模工业化生产奠定了坚实的技术基础。
