氧化葡聚糖/羧甲基壳聚糖动态席夫碱水凝胶用于硫化氢持续释放与烧伤创面微环境重塑

《Pharmaceutics》：Oxidized Dextran/Carboxymethyl Chitosan Dynamic Schiff-Base Hydrogel for Sustained Hydrogen Sulfide Delivery and Burn Wound Microenvironment Remodeling Zhishan Liu, Ying Zhu, Zhuoya Ma, Xuyang Ning, Ziqiang Zhou, Jinchang Liu, Youfu Xie, Gang Li and Ping Hu

本文针对传统烧伤敷料被动、功能单一的问题，研究人员开发了一种基于氧化葡聚糖(OD)与羧甲基壳聚糖(CMCS)席夫碱交联的动态可注射自修复水凝胶(ACMOD)，用于递送H2S供体ADT-OH。该水凝胶兼具优良的物理性能和持续的H2S释放能力，在体内外能有效调控氧化应激、炎症、血管生成和胶原沉积，显著加速大鼠全层烧伤创面愈合，为智能气体疗法敷料的研发提供了新策略。

　　

皮肤，作为人体最大的器官，是我们与外界环境之间的第一道防线。然而，烧伤，尤其是深层部分厚度和全层烧伤，会严重破坏这道屏障，引发一系列复杂的病理生理事件。与普通伤口不同，烧伤愈合过程往往漫长而充满挑战，其特征包括持续且过度的炎症、高水平的氧化应激、细菌易感性增加、新生血管形成受损以及成纤维细胞功能失调导致的异常胶原沉积。这些因素相互交织，常常导致愈合延迟、增生性瘢痕形成和长期的功能障碍，构成了临床上的重大难题。

传统的烧伤敷料，如凡士林纱布或硅胶敷料，主要扮演着被动覆盖物的角色。尽管它们提供了一个基本的物理屏障，但缺乏主动干预和调控伤口微环境的能力，难以满足现代精准医学对高质量再生愈合的要求。因此，开发具有内在生物活性、能够动态响应并主动促进伤口修复的“智能”敷料，已成为生物材料和再生医学研究的核心焦点之一。

近年来，气体信号分子生物学的发展揭示了内源性气体信号分子在组织修复和再生中的关键作用。硫化氢(H₂S)曾经仅被视为有毒的环境气体，如今已被认为是多种细胞功能的关键调节者。在皮肤伤口愈合中，H₂S具有多重生物学效应：它能通过抑制NF-κB等关键信号通路来抑制过度炎症；通过激活包括Nrf2通路在内的内源性抗氧化防御来缓解氧化应激；通过刺激内皮细胞增殖、迁移和成管来促进血管生成；并能调节成纤维细胞行为，在支持胶原合成的同时，潜在预防病理性瘢痕形成。

为了利用这些治疗益处，外源性H₂S供体被开发出来。其中，ADT-OH因其良好的释放动力学、高化学稳定性和相对于传统硫化物盐更高的H₂S产率而脱颖而出。然而，尽管有这些优势，用于伤口愈合的气体疗法的临床转化仍受到一个重大限制：难以实现气体介质在伤口部位的局部、持续和可控递送。全身给药常导致脱靶效应，且无法维持治疗相关的浓度。因此，构建一个能够将ADT-OH有效装载、保护并以可控方式直接释放到伤口微环境中的递送系统，对于充分实现其治疗潜力、推进气体疗法走向临床应用至关重要。

可注射水凝胶虽然可以作为药物载体，但其交联网络通常是静态且不可逆的。在这些传统系统中，结构完整性和功能完全依赖于维持这个永久网络。在动态的体内环境中承受机械应力时，这些水凝胶可能发生不可逆的破裂，导致结构完整性丧失、药物过早泄漏和敷料失效，这可能需要进行反复更换。这对于位于关节或其他高度活动解剖部位的烧伤创面尤为不利。因此，理想的伤口敷料不仅应具有良好的初始顺应性，还应具备自主修复结构损伤的能力，从而维持长期的屏障功能和可控的药物释放。

为了克服静态网络的这些固有缺点，自修复水凝胶应运而生。不同于其不可逆的对应物，这些先进材料的高效性恰恰不依赖于维持一个永久、静态的网络。相反，它们通过动态、可逆的交联相互作用实现高效能，例如席夫碱键、硼酸酯键和氢键。这种动态化学性质为维持完整性提供了一种根本不同的机制：在受到机械损伤时，这些可逆键优先解离以耗散能量，从而防止灾难性的网络破坏。一旦应力消退，这些键在受损界面迅速重新形成，使得宏观结构和力学性能得以自发恢复。简而言之，自修复水凝胶通过拥抱动态性——利用可逆键的断裂吸收能量，然后再形成来愈合，而非通过永久结构抵抗损伤。在这些系统中，由醛基和氨基反应形成的席夫碱水凝胶因其温和的反应条件、优异的生物相容性和快速的凝胶动力学，在伤口愈合应用中尤为引人注目。

在《Pharmaceutics》杂志发表的这项研究中，由Zhishan Liu、Ying Zhu等人组成的团队提出了一种将自修复水凝胶特性与H₂S介导的气体疗法相结合的集成治疗策略，用于烧伤创面愈合。为了实现这一目标，他们设计了一种基于羧甲基壳聚糖(CMCS)和氧化葡聚糖(OD)的席夫碱交联水凝胶，作为H₂S供体ADT-OH的智能递送载体。亚胺键的动态和可逆性不仅赋予了水凝胶自主自修复能力，还赋予其固有的pH响应性，使其能够响应烧伤创面特有的微酸性微环境，按需释放ADT-OH。持续的H₂S释放随后作为一种有效的生物信号，调控炎症、氧化应激和血管生成。研究人员系统地开发和评估了这一水凝胶平台，通过全面的体外和体内实验研究了其自修复行为、pH响应的H₂S释放曲线以及治疗功效。这项工作不仅为ADT-OH的局部、持续递送提供了一种有效策略，也拓宽了自修复水凝胶在基于气体信号分子的创面修复疗法中的应用。

研究中用到的主要关键技术方法：

研究人员采用了多项关键技术进行研究。材料方面，他们通过高碘酸钠氧化法合成了氧化葡聚糖(OD)，并通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和核磁共振氢谱(¹H-NMR)进行表征。水凝胶制备与表征是关键，他们通过氧化葡聚糖(OD)与羧甲基壳聚糖(CMCS)的席夫碱反应制备了水凝胶(CMOD)，并载入H₂S供体ADT-OH形成ACMOD。水凝胶的流变学、自修复、微观结构(扫描电子显微镜，SEM)、溶胀及药物/H₂S释放行为被系统评估。生物相容性通过溶血试验和细胞活力(MTT法)检测进行评估。体外功能评估是另一大块，包括细胞划痕实验、Transwell迁移实验评估内皮细胞迁移；活性氧检测评估抗氧化能力；H₂S特异性荧光探针检测细胞内H₂S生成；以及Matrigel成管实验评估促血管生成能力。在体内实验部分，他们建立了大鼠全层烧伤模型，评估了创面愈合率、组织病理学(H&E和Masson’s染色)、免疫荧光(检测活性氧、巨噬细胞表型CD86/CD206、血管内皮生长因子VEGF)以及炎症因子(ELISA法)的变化，并对主要器官和血液学指标进行了安全性评估。

研究结果：

3.1. OD与水凝胶的合成与表征

OD通过高碘酸钠选择性裂解葡聚糖中的邻二醇生成二醛基团而成功合成，其氧化度约为67%。水凝胶(CMOD)由OD溶液与不同比例的CMCS溶液混合形成。所有配方的凝胶时间均很短，其中CMCS:OD体积比为6:1的配方因其适宜的凝胶时间被选为后续实验。FT-IR光谱证实了席夫碱交联机制的成功，显示了C=N(亚胺键)的特征峰。

3.2. 水凝胶的形态与流变学特性

水凝胶展示了优异的宏观自修复能力，两片不同颜色的水凝胶半球在接触后2小时内无缝融合。SEM图像显示其内部为均匀、多孔的三维网络结构。流变学测试表明，水凝胶具有显著的剪切稀化特性，表明其具有可注射性。在频率扫描测试中，储能模量(G′)始终高于损耗模量(G″)，表现出固体样行为和长期稳定性。更重要的是，在交替应变步骤测试中，水凝胶的G′和G″在高应变(600%，超出线性粘弹区)下可被破坏，在低应变(1%)下又能迅速、完全地恢复，证实了其优异的微观自修复能力。

3.3. 溶胀与硫化氢生成特性

水凝胶在37°C下8小时内达到溶胀平衡(~28%)，显示出适中的溶胀能力。ACMOD水凝胶在96小时内表现出持续的H₂S释放，包括初始的快速释放阶段和后续的缓慢持续释放阶段，最终稳定在理论最大值的8%左右。

3.4. 体外药物释放曲线

ADT-OH从ACMOD水凝胶中的释放呈现双相模式：最初的24小时内约有70%的爆发式释放，随后是持续48小时的缓慢释放，直至达到平台期。这种释放动力学与观察到的H₂S生成曲线相符。

3.5. 血液相容性评估

CMOD和ACMOD水凝胶的溶血率极低，分别为1.19%和1.21%，远低于生物医学材料5%的安全阈值，证实了水凝胶系统优异的血液相容性。

3.6. 体外生物相容性与细胞迁移实验

MTT实验表明，在0-100 μmol/L浓度范围内，含ADT-OH的水凝胶提取物处理24小时后，细胞活力保持在80%以上，无显著细胞毒性。活/死染色结果进一步证实了水凝胶本身优异的细胞相容性。细胞划痕实验和Transwell迁移实验均显示，ACMOD水凝胶能显著增强人脐静脉内皮细胞的迁移能力，这归因于持续释放的H₂S。

3.7. 体外抗氧化、H₂S生成、促血管生成与抗炎特性

在抗氧化方面，ACMOD处理可显著降低由Rosup诱导的内皮细胞内活性氧水平，降低了约42%。通过H₂S特异性荧光探针(HSP)检测，ACMOD组细胞内绿色荧光显著增强，证实了其生成H₂S的能力。Matrigel成管实验表明，ACMOD水凝胶能显著促进内皮细胞形成更广泛、更互联的管状结构，分支点和总管长均显著增加。此外，ACMOD处理能显著降低HUVECs分泌的促炎细胞因子IL-1β的水平，显示了其抗炎潜力。

3.8. 体内烧伤创面愈合评估

在大鼠全层烧伤模型中，ACMOD水凝胶展现出卓越的治疗效果。早在第3天，ACMOD组的创面面积减少率(~61.79%)就显著高于对照组(~34.32%)。在整个观察期内，ACMOD组始终保持着最快的愈合速度。到第14天，ACMOD组的创面收缩率达到98.77%，接近完全愈合，效果优于对照组(89.12%)、CMOD组(89.98%)和商用3M敷料组(97.93%)。ELISA检测显示，在愈合后期(第14天)，ACMOD治疗显著下调了创面组织中促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达，同时上调了抗炎细胞因子IL-10的表达，表明其有效调控了创面微环境，使之转向抗炎促再生的状态。

3.9. 创面组织的免疫荧光分析

在愈合早期(第7天)，DHE染色显示ACMOD处理显著降低了创面组织的活性氧水平，证实了其体内抗氧化能力。同时，免疫荧光染色显示，与对照组相比，ACMOD处理显著下调了促炎M1型巨噬细胞标志物CD86的表达，而上调了抗炎M2型巨噬细胞标志物CD206的表达，表明H₂S能重编程巨噬细胞极化，促进其向M2表型转换。在愈合后期(第14天)，免疫荧光检测显示ACMOD组创面组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达显著增强，表明其具有强大的促血管生成作用。

3.10. 创面组织的组织学分析

H&E染色显示，在第7天，ACMOD组的创面间隙最短，新生上皮最厚，肉芽组织形成最旺盛。到第14天，ACMOD组的创面几乎完全再上皮化，并恢复了皮肤附属器结构。Masson’s三色染色显示，ACMOD组在愈合后期呈现出致密、排列有序且丰富的蓝色胶原纤维，其沉积量显著高于其他各组，表明愈合组织的质量和成熟度更高。此外，对主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的组织病理学检查和血液学分析均未发现ACM-OD水凝胶引起明显的系统毒性或异常，证实了其良好的生物安全性。

研究结论与意义

本研究成功开发了一种用于治疗全层烧伤的自修复水凝胶系统(ACMOD)。该水凝胶通过氧化葡聚糖(OD)与羧甲基壳聚糖(CMCS)之间的动态席夫碱反应形成，并通过整合H₂S供体ADT-OH，实现了持续的硫化氢释放。这一设计将动态水凝胶的优良物理特性(包括剪切稀化可注射性、快速自修复、渗出液吸收和维持湿润伤口环境)与H₂S气体疗法的多重治疗功能相结合。

综合的体内外评估结果有力地证明了ACMOD的显著功效。在大鼠模型中，ACMOD显著加速了伤口闭合，并在第14天实现了近乎完全的愈合。其促进修复的机制是通过多种H₂S介导的过程协同实现的：清除过量的活性氧以缓解氧化应激；将巨噬细胞极化从促炎的M1表型重编程为抗炎的M2表型，以化解持续性炎症；上调VEGF表达以刺激血管生成；以及促进致密且排列有序的胶原沉积