激光粉末床熔融制造锌银铜合金用于定制化可降解医疗植入物的细胞相容性评估

《Journal of Functional Biomaterials》：Cytocompatibility Assessment of L-PBF-Manufactured Zinc–Silver–Copper Alloys for Customized Biodegradable Medical Implants Barbara Illing, Jacob Schultheiss, Lukas Schumacher, Evi Kimmerle-Mueller, Ariadne Roehler, Alexander Heiss, Ulrich E. Klotz, Victor O. Okafor, Stefanie Krajewski and Frank Rupp

为解决可降解锌基植入体在临床应用中存在的初期细胞毒性问题，研究人员针对L-PBF（激光粉末床融合）制造的ZnAgCu、ZnAgCuMn、ZnAgCuTi合金，通过直接接触和间接浸提试验系统评估了其（包括后处理状态）对L929和SAOS-2细胞的生物相容性。研究发现，与抛光样品相比，未处理样品的高孔隙率和大表面积导致了较高的Zn2+离子初始释放和细胞毒性，而ZnAgCuMn合金在抛光后表现出相对更优的细胞相容性。这项研究强调了调控植入物表面状态以降低初期离子爆发、提高生物安全性的重要性。

　　

在骨科和牙科领域，骨折、骨缺损等疾病的治疗常常需要植入金属材料来提供临时支撑。传统的钛合金等永久性植入物虽然性能优异，但往往需要二次手术取出，给患者带来额外的痛苦和风险。因此，能够随着组织愈合而逐渐“溶解”在体内的可降解金属材料，成为了生物材料研究的热点。其中，锌（Zn）因其是人体必需的微量元素，且降解速度与骨骼愈合周期更为匹配，被寄予厚望。然而，锌的机械强度不够理想，于是科学家们通过添加银（Ag）、铜（Cu）、锰（Mn）等元素来开发合金。同时，激光粉末床融合（Laser Powder Bed Fusion, L-PBF）这项先进的3D打印技术，为制造形状复杂、高度个性化的植入物提供了可能，尤其适合为患者“量身定制”。

但理想很丰满，现实很骨感。锌及其合金真的足够“友好”吗？近年来，一些体外研究发出了警告：高浓度的锌离子（Zn²⁺）释放可能对周围细胞产生毒性。特别是L-PBF制造的部件，其表面通常粗糙多孔，这会导致更大的真实表面积，从而可能加剧初期离子的“爆发式”释放。这种初始毒性问题，成为了锌基可降解植入物走向临床应用的一道关键门槛。为了深入探究并解决这一问题，Barbara Illing, Jacob Schultheiss等研究人员在《Journal of Functional Biomaterials》上发表了一项研究，系统评估了三种L-PBF制造的锌合金（ZnAgCu, ZnAgCuMn, ZnAgCuTi）的生物相容性，并探索了表面处理和环境老化如何影响其细胞毒性。

为了回答这些问题，研究人员综合运用了多项关键技术。首先，他们通过气体雾化法制备合金粉末，并使用L-PBF技术制造了标准化的合金测试板。为了表征材料本身的性质，他们采用了显微计算机断层扫描（μCT）来分析内部孔隙率和密度分布，用扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜观察表面形貌和粗糙度。研究的核心是生物相容性评估，采用了两种经典方法：一是直接细胞相容性测试，将SAOS-2人成骨肉瘤细胞和L929小鼠成纤维细胞直接接种在合金板上，通过活/死染色观察细胞状态；二是间接浸提测试，将合金在细胞培养基中浸泡得到浸提液，然后用不同稀释度的浸提液培养细胞，通过BrdU ELISA法量化细胞增殖情况，这避免了Zn²⁺对某些检测方法的干扰。为了解离子释放动力学，他们通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）连续10天测量每日更换的浸提液中的离子浓度。此外，还通过动电位极化法测算了合金的瞬时腐蚀速率。研究特别设置了未处理、新抛光、以及经3个月环境老化后再抛光的表面状态对照组，以探究表面状态对生物相容性的影响。

3.1. 合金和粉末的表征

μCT和SEM结果显示，L-PBF制造的合金板表面粗糙，内部存在孔隙，其中ZnAgCuTi合金密度最低（约91.6%）。抛光处理可大幅降低表面粗糙度，使其接近传统轧制纯锌的水平。

3.2. 细胞相容性和离子释放

3.2.1. 直接细胞毒性：当细胞与合金板直接接触24小时后，几乎所有细胞都死亡或脱离表面，合金板周围形成了明显的细胞生长抑制区，表明直接接触具有高细胞毒性。

3.2.2. 细胞相容性浸提测试：使用24小时制备的未稀释浸提液培养细胞时，所有合金都显示出显著的细胞毒性，细胞增殖率极低。当浸提液被稀释后（特别是1:10稀释），细胞存活率有所上升，其中含有锰的ZnAgCuMn合金浸提液表现出相对最高的细胞增殖率。

3.2.3. 浸提液细胞相容性和离子释放的时间依赖性：这是一个关键发现。对于未处理的样品，初始24小时的浸提液毒性最强，随着浸泡时间延长（第3、5、10天采集浸提液），其细胞毒性逐渐降低，细胞增殖有所恢复，但始终未达到对照组（无浸提液）水平。而对于新抛光的样品，从第3天开始，其浸提液的细胞相容性就显著提高，并达到了与对照组相当的水平。ICP-OES测量揭示，Zn²⁺离子释放量在第一天达到峰值，随后几天急剧下降。未处理样品的离子释放量远高于新抛光样品，这与其较大的真实表面积直接相关。在所有合金中，新抛光的ZnAgCuMn合金显示出最低的Zn²⁺离子释放。研究还检测到微量的Cu²⁺和Mn²⁺释放，但未检测到Ag⁺和Ti离子。

3.3. 动电位极化

通过Tafel外推法计算的腐蚀速率显示，几种未处理合金的瞬时腐蚀速率都较高，但彼此之间无统计学显著差异。该结果与初期高离子释放的现象一致。

3.4. 老化对细胞毒性的影响

一个有趣的发现是，在空气中自然老化3个月的抛光合金板，其24小时浸提液的细胞毒性，显著高于刚刚抛光的新鲜合金板。这表明，除了表面粗糙度，材料表面的化学状态（如自然形成的氧化层）也是影响其生物相容性的重要因素。

研究人员在讨论部分对上述结果进行了深入分析。他们指出，L-PBF制造的锌合金初期细胞毒性主要归因于高表面积导致的Zn²⁺离子“爆发式释放”。抛光处理通过减少有效表面积显著降低了离子释放速度和总量，从而改善了生物相容性。ZnAgCuMn合金表现相对较好，可能得益于锰（Mn）元素的添加，已有文献表明Mn能细化晶粒、适度降低腐蚀速率，并且Mn²⁺本身对成骨可能有积极作用。而老化表面毒性增加，则可能与表面形成的锌氧化物、氢氧化物或碳酸盐等腐蚀产物层改变了表面化学性质有关，这无法仅用离子释放差异来解释。研究还强调，使用BrdU法而非可能受Zn²⁺干扰的MTT法等，是获得可靠细胞增殖数据的关键。培养基中添加的胎牛血清（FBS）会加速腐蚀，但也更贴近生理环境。

结论，这项研究明确指出，L-PBF制造的锌基可降解植入物虽然前景广阔，但其“原生”的粗糙多孔表面会引发初期高离子释放和细胞毒性，这是临床应用面临的主要挑战。后处理，特别是抛光，是改善其生物相容性的有效策略，能显著降低初期毒性。在研究的几种合金中，新抛光的ZnAgCuMn合金显示出最佳的生物相容性，是未来研发的优先方向。然而，材料在储存期间的自然老化也会对表面性质和生物反应产生不利影响，这提示植入物的预处理和储存条件也需要标准化。最后，作者展望未来，指出开发更先进的表面改性技术（如磷酸钙涂层、聚合物涂层等），以更精准地调控降解动力学、抑制初期离子爆发，是将这些个性化定制植入物安全应用于临床的必经之路。这项研究为优化可降解锌合金植入物的设计与制造提供了关键的实验依据和明确的改进方向。