综述：斑马鱼药物分析样品预处理技术的最新进展

《Pharmaceuticals》：Recent Advance in the Sample Pretreatments for Drug Analysis in Zebrafish Ting Wang, Chuyu Wang, Mingjing Luo, Xinyu Wang, Yiwen Chen, Zhi Yang, Guang Hu and Weikang Liu

这篇综述系统地总结了2014-2024年间用于斑马鱼药物分析的主流样品预处理技术。文章详述了液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)及其相关微萃取技术，深入比较了各类方法、溶剂与吸附剂，并剖析了斑马鱼复杂生物基质带来的挑战，特别是基质效应(ME)。文章还前瞻性地指出了未来向高效、高选择性、自动化及绿色预处理技术的发展趋势，为相关研究提供了重要参考。

　　

近年来，斑马鱼作为一种新兴的脊椎动物模型，因其具有与人类基因高度保守、个体小、繁殖快、胚胎透明等优势，在药物体内药效学和药代动力学研究中获得了广泛应用。然而，精确分析斑马鱼体内药物及其代谢物面临着独特的挑战。斑马鱼样品成分复杂，富含蛋白质、脂质、色素等内源性物质，这些基质成分会严重干扰分析结果，产生显著的基质效应。因此，在进行分析检测前，必须对样品进行一系列预处理，以提取、净化和浓缩目标分析物，这是确保分析成功的关键步骤。

斑马鱼样品经历的液相萃取

传统的液液萃取(LLE)因其操作简单、成本低廉，仍是常用的预处理方法，适用于生物化学检测（如甘油三酯、总胆固醇、天冬氨酸转氨酶(AST)/丙氨酸转氨酶(ALT)测定）和仪器分析。然而，传统LLE存在溶剂消耗量大、富集效率低、在脂质丰富的斑马鱼样品中易形成乳状液等固有缺陷。

为克服这些局限性，多种高级液相萃取技术得以发展。加速溶剂萃取(ASE)通过在密闭容器中施加高温高压，显著提高了提取效率，缩短了提取时间，但高温可能导致热不稳定化合物降解。中空纤维液相微萃取(HF-LPME)和分散液液微萃取(DLLME)等微萃取技术则代表了“绿色化学”方向，它们能极大减少有机溶剂消耗，并实现高倍数的分析物富集，富集因子最高可达279倍。例如，超声辅助DLLME已被成功用于斑马鱼中氧苯酮的分析。在溶剂选择上，单一有机溶剂（如甲醇、乙醇、己烷）和混合溶液各有适用场景，后者（如甲醇/水/乙酰胺体系）可通过调整极性或利用盐析效应来优化提取条件。

斑马鱼样品经历的固相萃取

固相萃取(SPE)技术基于选择性吸附与洗脱原理，能更有效地净化和富集复杂基质中的痕量目标物。传统的SPE柱（如Oasis? HLB）虽然步骤较多，但能与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)等检测技术良好兼容，实现高灵敏度的痕量药物分析。

分散固相萃取(DSPE)简化了操作，将吸附剂直接分散于样品中，无需过柱，显著缩短了分析时间。磁固相萃取(MSPE)是DSPE的改良，通过使用磁性或可磁化吸附剂，并借助外磁场进行分离，操作更为便捷，例如功能化的磁性金属有机框架复合材料可用于选择性分离斑马鱼中的孔雀石绿和结晶紫。其中，

固相微萃取(SPME)是目前极具前景的技术。它集采样、萃取、富集于一体，几乎无需溶剂，符合绿色化学原则。相较于传统LLE和SPE，SPME能提供更高的富集因子（某些涂层可达126,057倍），并将基质效应抑制在10%以下。新型SPME涂层（如金属有机框架(MOFs)、分子印迹聚合物(MIPs)）的开发进一步提升了其选择性和富集能力。更为先进的是，基于钨探针的生物相容性表面涂层SPME技术，甚至能实现对斑马鱼体内化合物的原位、在体、微尺度分析，无需额外的样品制备步骤。下图对比了传统SPE与SPME的操作流程差异。

在吸附剂方面，碳基吸附剂（如C₁₈）凭借其良好的生物相容性和疏水相互作用被广泛应用；硅基吸附剂（如Florisil、亲水-亲脂平衡(HLB)材料）具有大比表面积和可调控的表面修饰；而聚合物及聚合物材料（如聚苯乙烯、壳聚糖复合材料）则因其宽PH适用性和多样的作用位点（如离子交换、反相）展现出高选择性。

基质效应的评估策略

斑马鱼复杂的生物基质是导致分析误差的主要来源。基质效应通常表现为质谱分析中的离子抑制或增强。系统评估并补偿基质效应对于获得可靠的定量结果至关重要。

评估基质效应最标准的方法是提取后加标法。该方法通过比较加标至空白基质提取液中的分析物响应与同等浓度纯标准溶液的响应来计算基质效应。此外，在分析药物于不同组织（如脑、肝脏、肌肉）中分布时，可采用组织特异性电离效率因子(TSF)策略进行更精准的评估。

为补偿基质效应，常用的策略包括基质匹配校准和使用同位素内标法。基质匹配校准通过将校准标准品制备在与真实样品组成一致的空白基质中来校正信号偏差，方法简单但获取足量空白基质有时较为困难。而同位素标记内标法（如使用皮质醇-d₄）则是“金标准”，它在样品处理前加入，其理化性质与目标分析物几乎一致，可同时校正提取损失和电离过程中的基质干扰，但成本较高。下图展示了提取后加标法的评估流程。

未来展望

尽管斑马鱼样品预处理技术已取得长足进步，但仍面临诸多挑战，例如现场快速检测方案不成熟、难以平衡分析效率与操作简便性、以及缺乏跨研究的标准化流程。未来，该领域的发展将聚焦于更高效率、更高选择性和更高自动化程度。具体方向包括：开发智能、环保的预处理方法与材料；推动技术联用（如SPME-HPLC、μSPE-MS）；以及建立统一标准，以增强基于斑马鱼的药理学研究的可重复性和可比性。这些进步将充分发挥斑马鱼模型在药物发现与安全性评价中的巨大潜力。