靶向MYC转录因子降解的PROTAC分子设计与评估：机遇、挑战与启示

《Molecules》：Insights into the Design of MYC-Targeting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) Abdallah M. Alfayomy, Sven Hagemann, Matthias Schmidt, Ali Fouad, Mohamed Ayman El-Zahabi, Stefan Hüttelmaier and Wolfgang Sippl

本论文报道了研究人员为克服经典致癌转录因子MYC“不可成药”的挑战，设计合成了一系列基于EN4抑制剂、靶向CRBN/VHL E3泛素连接酶的新型PROTAC降解剂。研究评估了这些分子在多种癌细胞系中的活性和对MYC的降解效果，并探讨了其稳定性。结果表明，尽管成功合成了多种结构多样的PROTAC分子，但在生物学相关浓度下均未观察到显著的MYC蛋白降解，且化合物在微粒体中稳定性较差。该研究凸显了针对MYC这类固有无序蛋白进行靶向蛋白降解所面临的巨大挑战，为未来开发更有效的MYC靶向疗法提供了重要参考。

　　

在癌症研究领域，MYC转录因子堪称“明星”致癌基因。它像一部驱动细胞疯狂增殖的“总开关”，在超过一半的人类癌症中存在异常高表达。然而，将其“关闭”以治疗癌症却异常困难。MYC蛋白没有传统药物喜欢结合的、规整的“口袋”（即活性位点），其结构松散无序，功能发挥依赖于与其他蛋白质的“握手”（即蛋白质-蛋白质相互作用）。因此，MYC长期被贴上“不可成药”的标签。传统的小分子抑制剂难以有效阻断其功能。近年来，一种名为“蛋白降解靶向嵌合体”（PROTAC）的新技术横空出世，为“不可成药”靶点带来了曙光。它不追求高亲和力结合，而是像一个“分子双面胶”，一头拉住目标蛋白，另一头拉住E3泛素连接酶，将目标蛋白“标记”上泛素链，进而被细胞的“蛋白质粉碎机”——蛋白酶体降解。这为MYC靶向治疗提供了新思路。本研究正是基于此背景，尝试设计能够特异性降解MYC的PROTAC分子，探索攻克这一“顽固”靶点的可行性。

为了开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术：1) 有机合成化学：基于已知MYC抑制剂EN4及其类似物EN4-18的结构，通过酰胺偶联等方法，将其与源自CRBN（如来那度胺、沙利度胺衍生物）或VHL的E3连接酶配体连接，并系统改变连接臂的长度和连接位点，合成了数十种结构多样的PROTAC分子。2) 细胞生物学实验：在HEK293T、Panc-1和HCT-116等癌细胞系中，通过细胞活力检测评估化合物毒性，并利用蛋白质印迹法（Western blot）检测MYC蛋白水平的变化，以评估PROTAC的降解效力。此外，还使用了基于HiBiT-MYC/LgBiT的荧光素酶报告系统进行更灵敏的检测尝试。3) 药代动力学性质评估：采用高效液相色谱法评估了代表性PROTAC分子在细胞培养基中的非酶稳定性，并在小鼠肝微粒体中进行体外代谢稳定性测试，以预测其体内代谢命运。

2. 结果与讨论

2.1. 化学合成

研究人员成功设计并合成了一系列新型的MYC靶向PROTAC分子。合成策略核心是将报道的MYC抑制剂（EN4和EN4-18）与VHL或CRBN E3连接酶配体通过不同的连接臂和连接位点进行偶联。研究涵盖了基于来那度胺、沙利度胺、吡啶甲酰胺戊二酰亚胺等多种CRBN配体，以及基于VHL的配体，构建了结构多样的PROTAC库（16a–g, 21a–c, 27a, 27b, 32a–e, 34a–n）。所有最终化合物均经过高纯度合成和充分的分析表征（核磁共振氢谱/碳谱、高分辨质谱、高效液相色谱纯度分析）。

2.2. 非酶稳定性测试

在细胞培养基（DMEM）中对代表性PROTAC进行了24小时稳定性测试。结果显示，除化合物27b在24小时后仅保留约50%的原型化合物外，其他大部分化合物表现出相对较高的化学稳定性。其中，基于来那度胺和VHL的PROTAC稳定性最高，未检测到降解产物；而基于沙利度胺的PROTAC稳定性中等，24小时后产生少量降解产物。

2.3. 微粒体稳定性测试

为了评估化合物的体内应用潜力，研究人员在小鼠肝微粒体中测试了部分有希望的降解剂及参考化合物KL4-219A和EN4的稳定性。结果显示，所有测试的PROTAC以及两个参考抑制剂在2小时的孵育后都发生了快速降解，表明它们在体内可能面临迅速的代谢清除，限制了其用于体内研究的潜力。

2.4. 生物学测试

研究人员在HEK293T、Panc-1和HCT-116癌细胞系中对新合成的MYC PROTAC进行了系统评估。

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  细胞活力：大多数化合物在高达20-100 μM的浓度下，仅显示出中等的细胞活力降低，半数有效浓度（EC₅₀）值处于中等微摩尔范围。没有化合物能在测试浓度范围内完全杀死细胞。潜在原因可能包括细胞渗透性低、转运蛋白外排、内体捕获或细胞内快速代谢降解等。
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  MYC蛋白降解：对显示出细胞活力降低的化合物，进一步在EC₅₀浓度下处理细胞6小时，通过蛋白质印迹法检测MYC蛋白水平。令人遗憾的是，在生物学相关浓度下，没有任何一个合成的PROTAC能够检测到MYC的降解。作为阳性对照，已知的MYC降解剂KL4-219A在1 μM时导致约20%的MYC减少，在50 μM时导致约67%的显著降解。对部分VHL基PROTAC（34f, 34g）进行更详细的时间和浓度梯度分析发现，它们仅在特定时间点（2或4小时）表现出微弱且浓度依赖性的MYC降解，而34e和34l在所有条件下均未显示降解。使用更灵敏的HiBiT-MYC/LgBiT报告基因系统检测，所有化合物同样未能显著降低荧光素酶活性，这提示了更根本性的失败，例如细胞进入障碍或无法形成有效的三元复合物，而不仅仅是效力不足。

3. 研究结论与讨论

本研究系统地设计、合成并评估了一个全新的、结构多样的MYC靶向PROTAC分子库。尽管在化学合成上取得了成功，并获得了高纯度的化合物，但细胞水平的生物学评价结果却令人失望：这些PROTAC分子在多种癌细胞系中仅表现出微弱的抗增殖活性，并且在生物学相关浓度下均未能诱导MYC蛋白的有效降解。

该研究结果深刻揭示了针对MYC这类固有无序转录因子开发靶向蛋白降解剂所面临的重大挑战。失败的原因可能是多方面的：

1. 1.
   靶标特性：MYC的固有无序结构可能阻碍了与PROTAC分子形成稳定、高效的三元复合物（PROTAC-靶蛋白-E3连接酶），这是触发泛素化和后续降解的关键步骤。
2. 2.
   分子性质：合成的PROTAC可能由于细胞渗透性差、被外排泵清除、在细胞内被隔离（如困于内体）或代谢稳定性极差（微粒体实验证实了其快速降解）而无法在细胞内达到有效浓度和作用位点。
3. 3.
   连接臂与连接策略：尽管本研究尝试了不同的连接臂长度和连接位点，但可能仍未找到最优的几何构型，以实现同时高效结合MYC和E3连接酶。

这些发现强调了在PROTAC开发中，仅拥有对靶蛋白有结合能力的配体是不够的。对于像MYC这样具有挑战性的靶点，需要更深入理解其与PROTAC和E3连接酶的相互作用模式，并优化PROTAC分子的整体药代动力学性质。本研究的“负面”结果同样具有重要价值，它为未来优化MYC降解剂的化学结构、探索新的E3连接酶、或采用不同的靶向策略（如分子胶、疏水标签等）提供了关键的实验数据和思考方向。该研究论文发表在《Molecules》期刊上，其工作增进了对设计靶向难成药转录因子的PROTAC所面临障碍的理解，标志着在攻克“不可成药”靶点MYC的漫长征程中，又迈出了坚实而必要的一步。