《Molecules》：Evaluation of the Cytotoxicity of Biochar Aqueous Extract in Caco-2 Cells: Time-Dependent Regulation of Apoptosis, Associated with miRNA Modulation
Sidra Amin,
Klaudia Marcinkowska,
Magdalena Wo?oszyńska,
Sebastian Opaliński,
Dawid Skrzypczak,
Pawe? Wiercik,
?ukasz Bobak and
Agnieszka ?mieszek
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本研究关注生物炭水提物（BC-AE）的潜在生物活性与安全性。为解决其生物效应不清、尤其对肠道上皮细胞存活通路的影响未知等问题，研究人员以Caco-2细胞为模型，探讨了BC-AE对细胞代谢、凋亡及miRNA网络的调控作用。结果显示，BC-AE暴露呈现时间依赖性效应，短期（24 h）通过晚期凋亡降低细胞活力，长期（72 h）则增加坏死，并伴随BAX、MCL-1蛋白及miR-15b、miR-21等关键miRNA的上调。该研究强调了评估生物炭生物活性时考虑暴露时长的重要性，为理解其生物作用机制提供了新见解。
在追求可持续农业和畜牧业发展的进程中，生物炭作为一种由有机生物质热解产生的富碳材料，因其改良土壤、作为饲料添加剂以促进肠道健康等潜力而备受关注。然而，随着其应用范围的扩大，一个核心问题逐渐浮出水面：除了已知的物理吸附和化学改良作用，生物炭及其可溶性成分是否会对哺乳动物细胞产生直接的生物活性影响？特别是当它作为饲料添加剂或潜在生物材料被口服摄入时，其对人体肠道第一道防线——肠上皮细胞的影响究竟如何？目前，关于生物炭，尤其是其水溶性提取物，在细胞和分子水平上如何影响细胞存活、死亡通路以及表观遗传调控网络（如微小RNA）的研究几乎是一片空白。这种认知的缺乏，严重制约了我们对其生物安全性和潜在医用价值（如药物递送、生物传感）的准确评估。
为了填补这一知识缺口，由Sidra Amin, Klaudia Marcinkowska, Magdalena Wo?oszyńska, Sebastian Opaliński, Dawid Skrzypczak, Pawe? Wiercik, ?ukasz Bobak 和 Agnieszka ?mieszek组成的研究团队在《Molecules》期刊上发表了一项研究。他们以广泛使用的人结肠腺癌细胞系（Caco-2）作为肠道上皮模型，深入探究了生物炭水提物（BC-AE）的细胞毒性及其背后的分子机制。研究团队关注两个关键维度：暴露时间（24小时与72小时）和多个分子层面（细胞代谢、形态、凋亡/坏死、基因与蛋白表达、微小RNA网络），旨在全面解析BC-AE与肠道细胞的相互作用。
研究者们运用了多学科交叉的技术方法。首先，他们通过MTS法筛选BC-AE对Caco-2细胞代谢活性的影响。基于筛选结果，选定特定浓度进行后续深入的功能实验。接着，利用倒置显微镜和免疫荧光显微镜观察细胞形态和骨架结构的变化。通过流式细胞术结合膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI）染色，精准区分和量化活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞的比例。在分子机制层面，研究采用实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测了与细胞存活相关的关键基因（如BAX, BAD, BCL-2, MCL-1, P53等）和一组精选的微小RNA（如miR-15b-5p, miR-19a-3p, miR-21-5p等）的表达水平。同时，利用蛋白质印迹法（Western blotting）验证了BAX、BAD、BCL-2和MCL-1等关键凋亡调控蛋白的表达变化。此外，研究还对所用生物炭及其水提物进行了包括元素分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和多环芳烃（PAHs）分析在内的全面表征，以确保实验材料的可靠性和安全性。
研究结果揭示了生物炭水提物对Caco-2细胞复杂且随时间变化的生物效应：
1. BC-AE在筛选试验中对Caco-2细胞显示低细胞毒性
MTS实验表明，BC-AE在测试浓度范围内细胞毒性较低。值得注意的是，在3 mg/mL浓度下处理72小时后，Caco-2细胞的代谢活性相比未处理对照组有统计学上的显著增强。因此，后续所有功能实验均选用了3 mg/mL这一浓度。
2. 功能实验——分析3 mg/mL生物炭水提物（BC-AE）对Caco-2活性的影响
2.1. BC-AE维持Caco-2细胞形态和结构，但长期处理可能逐渐影响其生长模式
显微镜观察显示，处理24小时后，细胞形态正常，甚至处理组的细胞集落看起来比对照组更“发达”。然而，处理72小时后，细胞未能形成连续的细胞单层，集落扩张也明显减少，表明长期暴露可能对细胞增殖或集落形成有轻微的抑制作用，但未观察到明显的细胞毒性形态变化。
2.2. BC-AE暂时性调节Caco-2细胞的凋亡和坏死动态
流式细胞术分析发现，BC-AE处理24小时后，细胞活力下降，这与晚期凋亡细胞的增加有关。而处理72小时后，虽然细胞活力未进一步显著下降，也未诱导凋亡，但坏死细胞的比例却显著增加。这提示BC-AE的作用模式具有时间依赖性转变。
2.3. BC-AE调节生存相关miRNA的内源水平
RT-qPCR结果显示，BC-AE对微小RNA的调控也具有时间特异性。处理24小时后，miR-19a、miR-33a-5p和miR-486-3p的水平显著升高。而处理72小时后，miR-15b-5p和miR-21-5p的表达被显著上调。在所有分析的miRNA中，miR-21-5p表达量最高，miR-155-5p表达量最低。
2.4. BC-AE在mRNA和蛋白质水平调控抗凋亡和促凋亡信号
在基因转录水平，处理24小时后，促凋亡基因BAD的mRNA水平显著下降，BAX/BCL-2的mRNA比率也降低，提示可能向抗凋亡状态偏移。处理72小时后，抗凋亡基因MCL-1和肿瘤抑制基因P53的mRNA水平显著下降。然而，在蛋白质水平， Western blotting 分析显示，处理24小时对BAD、BAX、BCL-2或MCL-1蛋白积累无影响。但处理72小时后，促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白MCL-1的表达水平均显著增加。这种mRNA与蛋白水平的不一致，提示存在转录后调控机制。
研究结论与讨论强调了这项工作的创新性与重要性。
本研究表明，生物炭水提物对肠道上皮细胞Caco-2的生物学影响是动态且时间依赖的。短期暴露（24小时）在增强细胞代谢活性的同时，通过诱导晚期凋亡降低了细胞活力。而长期暴露（72小时）则导致细胞坏死增加，并伴随着促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白MCL-1的同时上调，以及促凋亡相关miR-15b和具有复杂背景的miR-21的表达升高。这种BAX和MCL-1蛋白的并发上调，揭示了一种复杂且可能具有补偿性的细胞应激反应，反映了在BC-AE暴露下促凋亡和促存活信号通路之间的相互作用。同时，BC-AE对miR-15b、miR-21等关键调控性微小RNA的调节作用，首次提示了生物炭可能通过表观遗传层面（即miRNA网络）与宿主细胞相互作用的新途径。
这项研究的重要意义在于，它将生物炭的生物活性评估从传统的物理化学性质拓展到了细胞信号传导和表观遗传调控的分子层面。研究结果明确警示，在评估生物炭（尤其是其可溶性成分）的安全性及潜在应用时，暴露持续时间是与作用浓度同等关键的决定性因素。尽管本研究因使用单一浓度和未进行肠道屏障功能分析而存在局限，且Caco-2作为癌细胞系有其固有特性，但它无疑为理解生物炭与肠道细胞的分子对话迈出了重要的第一步。未来需要在更接近生理的模型中进行深入研究，以全面揭示生物炭在动物和人类健康中的应用潜力与风险边界。
