以气单胞菌为哨兵生物评估巴塞罗那都会区水处理系统中抗生素耐药性传播的潜力研究

《Antibiotics》：Characterizing Aeromonas spp. as a Potential Sentinel Organism for Antimicrobial Resistance Dissemination in Wastewater and Drinking Water Treatment Systems: A Case Study in the Barcelona Metropolitan Area, Spain Laura Mondéjar, Victoria Ballén, Yaiza Gabasa, Laura Castellsagués, Anna Pinar-Méndez, Carles Vilaró, Belén Galofré, Aida González-Díaz, Sara Martí and Sara M. Soto + 1 author

本研究聚焦于评估抗生素耐药性（AMR）在水处理系统中的传播问题。为应对此挑战，研究人员在西班牙巴塞罗那都会区，选取了两种废水处理厂（WWTP）和一种饮用水处理厂（DWTP）作为研究对象，以抗生素耐药性气单胞菌（Aeromonasspp.）为哨兵生物，系统性地分析了其耐药谱、抗性基因、毒力因子、基因转移能力及在各级处理过程中的持久性。研究发现了高比例的多重耐药菌株及关键耐药基因（如 blaMOX， sul1）的广泛存在，证实了WWTP和DWTP可作为抗生素耐药菌的储存库，并证明了水平基因转移（HGT）的潜力。该工作为水环境中AMR监测提供了有效的哨兵生物，并为评估水处理工艺效能提供了科学依据，对保障城市水循环安全、特别是再生水利用的监管具有重要公共卫生意义。

　　

在城市化与公共卫生挑战交织的今天，一个看不见的威胁正在我们赖以生存的水循环中悄然扩散——抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）。想象一下，数以万计的微生物，包括那些对抗生素“刀枪不入”的细菌，正通过我们排放的生活和医疗废水进入庞大的水处理系统。废水处理厂（Wastewater Treatment Plants, WWTPs）本应是一座坚固的“净化堡垒”，但由于抗生素、重金属等选择压力的持续输入，这里反而变成了耐药细菌（Antibiotic-Resistant Bacteria, ARB）和抗性基因（Antibiotic-Resistance Genes, ARGs）滋生的“热点”与交流中心。更令人担忧的是，经过初步处理的再生水可能会用于农业灌溉、生态补水，甚至成为饮用水处理厂（Drinking Water Treatment Plants, DWTPs）的补给水源。如果这些耐药微生物及其携带的“武器库”（抗性基因）未能被有效清除，它们就可能重新进入人类的生活圈，对公共卫生构成严重威胁。然而，现有的水处理工艺并非专门为清除耐药菌和抗性基因而设计，常规的微生物监测指标（如大肠杆菌）也难以反映环境中土著耐药菌群的动态。那么，我们如何有效追踪和预警水环境中AMR的传播？有没有一种能“见微知著”的哨兵生物，可以作为评估水处理效能、预警环境健康风险的“晴雨表”？

为了解决这一系列问题，由Laura Mondéjar、Victoria Ballén等人组成的研究团队，在西班牙巴塞罗那都会区开展了一项具有前瞻性的案例研究。他们的目光投向了水生环境中无处不在的一类细菌——气单胞菌（Aeromonasspp.）。这类细菌不仅是重要的机会性病原体，而且常常携带临床相关的抗性基因，其在水中的存续时间甚至可能超过传统的粪便污染指示菌。这使它们成为监测AMR在水环境中传播的潜力巨大的“哨兵”。该研究旨在全面评估气单胞菌在这一角色中的适用性，为此，研究人员从巴塞罗大都会区的两个WWTP（Baix Llobregat 和 Gavà-Viladecans）和一个DWTP（Sant Joan Despí）的不同处理阶段，采集了2023年冬夏两季的样本。他们成功分离出428株抗生素耐药的气单胞菌，并对它们进行了“全身体检”。

为了回答上述核心问题，研究人员部署了一套多维度、高通量的“侦探工具箱”。首先，他们采用了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对菌株进行初步鉴定。接着，利用纸片扩散法对分离菌株进行了全面的抗菌药物敏感性测试，以绘制其耐药谱。为了探究耐药性背后的分子机制，他们通过聚合酶链式反应（PCR）广泛筛查了包括β-内酰胺酶、磺胺类、喹诺酮类等多种抗性基因，以及整合子、重金属耐受基因和毒力因子基因。研究还通过体外实验评估了菌株的生物膜形成能力，并设计配对接合实验，直接验证了抗性基因在气单胞菌与大肠杆菌（Escherichia coli）之间双向水平转移的潜力。最后，研究团队对筛选出的多重耐药和广泛耐药菌株进行了全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS），通过多位点序列分型和系统发育分析，揭示了优势克隆在时间和空间上的传播与持久性。这项系统性的研究成果最终发表在了专业期刊《Antibiotics》上。

结果

2.1. 气单胞菌分离株的鉴定

在总计分离出的991株抗生素耐药菌中，气单胞菌属是数量最多的菌属，共计428株。经鉴定，这些菌株包括 A. caviae、A. veronii、A. hydrophila等多个物种，其中部分为已知的机会性致病菌。

2.2. 处理阶段对气单胞菌在WWTPs和DWTP中流行率的影响

研究显示，两个WWTP的处理过程总体上能减少气单胞菌的数量，但效果和模式存在差异。在Baix Llobregat WWTP的三级处理出水口，菌株数量出现中度回升，而在采用旋转超滤和最终氯化的Gavà-Viladecans WWTP，菌株数量则呈持续下降趋势。Sant Joan Despí DWTP的出水口则未检出气单胞菌，表明饮用水处理工艺可将其有效清除。

2.3. 抗生素耐药谱和分类

气单胞菌分离株对多种抗生素表现出高频率的非敏感性，尤其是甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和头孢西丁。超过76%的菌株被归类为多重耐药（Multidrug Resistant, MDR），甚至有1.6%为广泛耐药（Extensively Drug-Resistant, XDR）。这些耐药菌株在各个处理阶段（包括最终出水）均有检出。

2.4. 产超广谱β-内酰胺酶、AmpC和碳青霉烯酶气单胞菌分离株的表型鉴定

在240株对三代头孢菌素非敏感的菌株中，63.7%被表型鉴定为产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株，54.6%鉴定为产AmpC酶菌株。在碳青霉烯类非敏感菌株中，进一步检测出了KPC、VIM等临床重要的碳青霉烯酶。

2.5. 抗生素抗性基因

研究检测到了种类繁多的抗性基因。在β-内酰胺耐药菌株中，bla_MOX基因占主导。在磺胺类耐药菌株中，sul1基因最为常见。此外，还检出了碳青霉烯酶基因（bla_KPC, bla_VIM）以及粘菌素耐药基因（mcr-3）等。

2.6. 整合酶、重金属耐受和毒力因子基因

高达70.1%的菌株携带1类整合酶基因（intI1）。21.7%的菌株携带汞耐受基因（merA）。绝大多数菌株（97.9%）携带至少一种毒力因子基因，如act、alt等，表明其具有潜在的致病性。

2.7. 分离株的生物膜形成能力

约一半的菌株显示出生物膜形成能力。生物膜形成菌在处理过程的各个阶段普遍存在，可能增强其在环境中的持久性和对消毒措施的耐受性。

2.8. 水平基因转移

接合实验证实，抗性基因和毒力因子基因可以在气单胞菌与大肠杆菌之间进行双向转移。例如，A. caviae可将携带 bla_PER、sul1、intI1和 act基因的质粒转移给大肠杆菌；反之，大肠杆菌也可将携带 bla_KPC基因的质粒转移给气单胞菌。

2.9. 全基因组测序

对84株菌进行全基因组测序，发现了高度的遗传多样性，共鉴定出62个序列型，其中46个为新发现的。值得注意的是，序列型ST3458的克隆在多个采样期、不同处理厂及处理阶段被重复检出，显示出强大的环境适应性和持久性。该克隆携带包括 mcr-3在内的多种抗性基因。

2.10. 遗传决定因素之间的关联和季节变化

统计分析揭示了不同基因之间的潜在关联。例如，intI1基因的存在与 sul1、merA等基因显著相关。然而，在夏季和冬季分离株之间，未发现明显的季节性差异。

结论与讨论

本研究通过对巴塞罗那都会区水处理系统中抗生素耐药气单胞菌的系统表征，得出了一系列关键结论。研究发现，WWTPs和DWTPs是抗生素耐药气单胞菌的重要储存库。这些菌株不仅普遍具有多重耐药性，而且广泛携带可移动的遗传元件、毒力因子基因和重金属耐受基因。研究通过实验直接证实了抗性基因在水生细菌（特别是气单胞菌与大肠杆菌这类条件致病菌）之间双向水平转移的现实可能性，这为AMR在环境中的快速传播和进化提供了直接证据。全基因组测序进一步揭示了特定克隆（如ST3458）能够跨越不同的水处理阶段持续存在，甚至出现在旨在回用的三级和高级三级处理出水中，凸显了它们在复杂水环境中的顽强生命力。

这项研究的意义重大。首先，它强有力地支持了将气单胞菌属作为监测水环境中AMR传播的“哨兵生物”或生物标志物。与传统的粪便指示菌（如大肠杆菌）相比，气单胞菌是水环境中的土著菌，能够更稳定地反映环境自身AMR的负荷和动态，尤其是在再生水回用等粪便污染指示意义不明确的场景中。其次，该研究为评估不同水处理工艺去除耐药细菌和抗性基因的效能提供了详细的基准数据和科学依据，指出了现有工艺（特别是某些三级处理组合）在控制AMR传播方面可能存在的薄弱环节。最后，研究强调了在“一体化健康”框架下，加强环境AMR监测的重要性。随着全球范围内水回用政策的推广（如西班牙皇家法令1085/2024和欧盟条例2020/741），确保再生水在市政、工业和生态应用中的微生物安全变得至关重要。将气单胞菌等环境哨兵生物纳入监测体系，与现有指标互补，可以更全面地预警由水循环介导的公共卫生风险，为制定更有效的水资源管理策略和AMR防控政策提供关键支撑。