《Plants》：Identification and Validation of NAC Transcription Factors Enhancing Phenolic Acid Production in Perilla frutescens
Jiayi Xu,
Ping Wang,
Junmei Lian,
Linqiang Zhang,
Xiaobi Zhang,
Yan Sui,
Jiankang Chen,
Heng Wei,
Yihan Wang and
Peng Di
+ 5 authors
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本研究旨在阐明紫苏(Perilla frutescens)酚酸生物合成的转录调控机制。针对NAC转录因子(TF)家族调控作用不明的现状，研究人员通过全基因组鉴定，系统分析了108个PfNACs，筛选出PfNAC29、PfNAC40和PfNAC80。功能验证表明，三者通过特异性结合PfC4H启动子的CATGTG基序，正向调控其转录，并在转基因发根中显著提升了迷迭香酸(RA)、咖啡酸和芥子酸的积累。该研究为利用分子育种和代谢工程策略提高紫苏药用价值提供了关键靶点和理论依据。
紫苏是一种在东亚地区广泛种植的药用兼食用植物，以其丰富的酚类化合物而备受关注。酚酸是紫苏中主要的水溶性次生代谢产物，具有抗过敏、抗肿瘤、调节发育和植物生长等多种生物活性。随着全球健康产业的快速增长，对天然生物活性物质的需求日益增加，紫苏的种植规模和市场价值显著上升，已成为高价值天然产物的重要原料。然而，尽管酚酸在苯丙烷途径中合成机制的基本框架已被勾勒，但其复杂的转录调控网络，尤其是NAC转录因子家族在其中扮演的角色，仍然笼罩在迷雾之中。此前的研究多聚焦于单个基因或局部调控，缺乏对NAC家族成员的系统性鉴定与功能研究，这限制了我们从全局视角理解紫苏酚酸代谢调控的能力，也阻碍了通过代谢工程高效提升目标产物产量的精准育种实践。
为了填补这一知识空白，研究人员以紫苏为研究对象，在最新基因组数据的基础上，对NAC转录因子家族进行了全面的全基因组分析，旨在系统揭示其调控酚酸生物合成的功能与机制。本研究发表在《Plants》杂志。
研究者采用了多项关键技术方法。首先，利用隐马尔可夫模型在紫苏全基因组中鉴定NAC家族成员，并进行了系统进化、保守基序、顺式作用元件等生物信息学分析。其次，通过酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验，验证了目标转录因子与顺式元件的互作及转录激活活性。再次，通过构建过表达载体，利用发根农杆菌介导的转基因技术，在紫苏中建立了稳定的过表达发根体系。最后，通过超高效液相色谱-质谱联用技术定量分析转基因材料中酚酸的含量变化，并通过实时定量PCR检测了相关生物合成途径基因的表达水平。
研究结果
2.1. PfNAC基因的染色体分布与特征
基于全基因组搜索，共鉴定出108个PfNAC转录因子。染色体定位分析显示，其中106个基因不均匀地分布在20条染色体上。蛋白质序列分析表明，PfNAC蛋白在长度、分子量和等电点方面存在显著多样性。
2.2. PfNACs的多序列比对与系统发育分析
多序列比对揭示了NAC结构域典型的五个保守亚结构域。通过构建紫苏PfNAC与拟南芥AtNAC蛋白的系统发育树，将PfNAC蛋白分为17个亚组，揭示了其进化关系。
2.3. PfNACs的基因结构与保守基序分析
保守基序分析鉴定出12个基序，其中基序1-5构成了NAC结构域的核心DNA结合区。基因结构分析显示，内含子数量在0到8之间，多数基因含有3-4个外显子。
2.4. PfNAC启动子的顺式作用调控元件分析
对转录起始位点上游2000 bp区域的顺式作用元件进行分析，鉴定出激素响应、胁迫响应、光响应和发育相关等四类元件。其中光响应元件最为丰富，暗示PfNAC基因的表达可能受光信号强烈调控。
2.5. PfNAC基因在紫苏不同组织中的表达模式
基于公开的RNA-seq数据，分析了PfNAC基因在根、茎、叶中的表达谱。聚类分析揭示了组织特异性表达簇，部分基因在所有组织中均呈现高转录丰度。
2.6. PfNAC基因复制事件与共线性分析
种内共线性分析鉴定出33对由全基因组复制事件产生的PfNAC基因对。非同义/同义替换率均小于1，表明PfNAC基因家族经历了强烈的纯化选择。与黄芩、丹参和芝麻的种间共线性分析，揭示了进化关系。
2.7. 亚细胞定位分析
通过在本氏烟草叶片中瞬时表达融合蛋白，确定了PfNAC40和PfNAC80定位于细胞核，而PfNAC29则同时定位于质膜和细胞核，表明其可能存在不同的激活机制或功能。
2.8. 酵母单杂交实验
实验证实，PfNAC29、PfNAC40和PfNAC80均能特异性结合PfC4H启动子中的CATGTG顺式作用元件。
2.9. 双荧光素酶报告基因实验
实验证明，PfNAC29、PfNAC40和PfNAC80均能显著激活由PfC4H启动子驱动的荧光素酶报告基因的表达，表明它们是PfC4H转录的正向调控因子。
2.10. 在转基因发根中过表达PfNACs
在紫苏转基因发根中过表达PfNAC29、PfNAC40和PfNAC80，通过UPLC-MS分析发现，迷迭香酸、咖啡酸和芥子酸的积累量均显著增加。qPCR分析进一步显示，苯丙烷途径关键基因的表达被上调。
结论与讨论
本研究首次在紫苏中完成了NAC转录因子家族的全基因组鉴定与系统分析，共发现108个成员，并将其分为17个亚组。研究聚焦于PfNAC29、PfNAC40和PfNAC80三个关键成员，通过多层面的功能验证，构建了一条清晰的调控通路：这些NAC转录因子通过特异性识别并结合酚酸生物合成关键酶基因PfC4H启动子区的CATGTG基序，激活其转录，进而上调整个苯丙烷途径，最终导致迷迭香酸等主要酚酸化合物的大量积累。尤为值得注意的是，PfNAC29独特的质膜与细胞核双重定位，暗示其可能通过膜信号感知与传递，整合环境或发育信号，进而进入细胞核行使转录调控功能，这为理解植物次生代谢的复杂环境适应性调控提供了新视角。
该研究的发现具有重要的理论与应用价值。在理论层面，它不仅系统描绘了紫苏NAC家族的基因组图谱，更通过功能实验将特定NAC成员与酚酸生物合成途径直接联系起来，深化了对这一重要药用植物次生代谢转录调控网络的理解。在应用层面，PfNAC29/40/80被鉴定为高效的正向调控因子，为通过分子育种或代谢工程策略定向改良紫苏品种、提高目标酚酸产物的含量提供了强有力的候选基因和精准靶点。考虑到酚酸（尤其是迷迭香酸）是重要的抗氧化代谢物，能够增强植物对氧化和环境胁迫的耐受性，这些NAC基因也可能成为培育抗逆性更强紫苏品种的宝贵遗传资源。总而言之，这项研究为紫苏这一传统药用植物的现代生物技术开发与利用奠定了坚实的分子基础，并展示了转录因子工程在提升药用植物经济与药用价值方面的巨大潜力。
