《Toxics》：Evaluating Toxicity and Anti-Osteogenic Activity of Artemisinin-Inspired Endoperoxides in Zebrafish Larvae
Yaryna S. Buzan,
Gil Martins,
Bruno M. S. Ferreira,
Inês C. C. Costa,
Maria L. S. Cristiano and
Paulo J. Gavaia
1. 引言
青蒿素及其相关的内过氧化物衍生物因其广泛而多样的生物活性和医学应用而受到特别关注。青蒿素及其部分衍生物被广泛用作抗疟药，其多靶点抗疟原虫作用主要基于三种假设：产生活性氧（ROS）破坏寄生虫氧化还原稳态；产生以碳为中心的自由基，使寄生虫蛋白质烷基化，并干扰铁原卟啉IX的解毒；抑制疟原虫（Plasmodium falciparum）ATPase 6 (PfATP6)，这是一种对钙稳态至关重要的肌浆/内质网Ca2+-ATPase (SERCA)。研究证据表明，青蒿素通过抑制Ca2+-ATPase破坏寄生虫的钙稳态，这引发了研究者对其是否可能抑制其他生物体（如宿主）中类似Ca2+-ATPase的兴趣。
斑马鱼（Danio rerio）因其独特的生物学特性、发育透明度、易于体内成像、易于遗传操作以及基因组数据的可获得性，是生物医学研究中广泛使用的模型。在骨骼研究方面，斑马鱼是一个公认的模型，主要用于研究骨生成和模拟人类骨骼疾病，为筛选抗骨生成化合物提供了高效平台。
本研究首次评估了青蒿素启发的内过氧化物作为抗骨生成分子的潜力。我们旨在利用斑马鱼幼虫作为脊椎动物模型，研究新型合成内过氧化物对钙稳态的影响，检查这些化合物是否改变Ca2+-ATPase活性或靶向参与骨化的其他分子途径，并评估它们在非寄生生物中的潜在毒性和生物活性。为了评估过氧化物官能团对活性的重要性，还制备了缺乏过氧键的选定醚类似物，并在类似条件下研究了它们的特性。
2. 材料与方法
2.1. 化学品 所有合成试剂均购自商业来源，未经进一步纯化即使用。
2.2. 合成化合物的结构表征分析 使用JEOL 500 MHz系统记录1H和13C核磁共振（NMR）谱，使用氘代溶剂。化学位移以四甲基硅烷（TMS）为内标。熔点测量使用SMP30仪器。质谱分析在Orbitrap Elite质谱仪上进行。
2.3. 合成 1,2,4,5-四噁烷及其醚类似物是通过调整文献中先前描述的程序合成的。详细的合成步骤和化学表征条件在补充材料中提供。
2.4. 斑马鱼幼虫饲养 实验使用在海洋科学中心（CCMAR, Faro, Portugal）维持了十代以上的野生型（WT）斑马鱼（AB品系）繁殖种群作为胚胎来源。饲养系统在受控的14小时光照/10小时黑暗光周期、环境湿度约60%、室温24±1°C下运行。水质通过生物过滤、机械过滤、活性炭过滤和紫外线灭菌维持。每天更新约10%的总水量。系统水温保持在28±1°C，pH为7.5±0.2，电导率为750±30 μS/cm。亚硝酸盐和铵浓度每周监测并保持在0.1 mg/L以下，硝酸盐水平在整个实验期间保持在50 mg/L以下。成年鱼交配以获得幼虫。产卵后收集胚胎，并在E2培养基中维持。
2.5. 毒性测试和LC50计算 为了评估合成内过氧化物的毒性，我们通过斑马鱼幼虫的浓度-反应实验测定了导致50%致死率的浓度（LC50）。对于每种化合物，首先测试了四个浓度（100、50、25和5 μM）。根据第一次实验记录的死亡率，用优化的、更窄的剂量反应范围进行后续实验，以准确测定每种化合物的LC50值。对于每个评估的化合物浓度，将受精后3天（3 dpf）的WT-AB幼虫分配到12孔板中，一式三份。将斑马鱼幼虫（n=9）置于每个孔中，孔内含有2 mL含有相应化合物浓度的处理溶液。暴露持续72小时。在此期间，每天更换70%的处理溶液以确保水质和化合物的稳定性。在暴露24、48和72小时记录死亡率。基于72小时获得的累积死亡率值，使用AAT Bioquest LC50计算器计算每种化合物的LC50值。
2.6. 使用鳃盖系统评估矿化 测定LC50值后，在低于LC50的化合物特定浓度范围内对斑马鱼幼虫进行矿化分析。将3 dpf的WT-AB斑马鱼幼虫转移到12孔板中，密度为每孔5条幼虫，置于5 mL水中。幼虫暴露于每种化合物的浓度范围：YB1（1, 6, 30 μM）、YB9（0.5, 2, 8 μM）、YB11（1, 6, 30 μM）、YB17（0.5, 2, 6 μM）、IC22（1, 4, 20, 30 μM）、IC26（12, 36, 60 μM）、IC33（2, 8, 40 μM）、T2（0.5, 2, 5 μM）。使用乙醇（0.1%）和二甲基亚砜（DMSO）（0.1%）作为阴性对照（溶剂），使用10 pg/mL的骨化三醇作为阳性对照。每天更新处理培养基（总体积的70%），直到处理期结束。用0.186 mg/mL的MS-222麻醉斑马鱼幼虫以确保成像期间的固定。用0.01%茜素红S（AR-S）在Milli-Q水中（pH 7.4）配制溶液对幼虫染色15分钟，室温，然后用Milli-Q水洗涤两次，每次5分钟。
使用MZ10F荧光立体显微镜连接DFC7000T彩色相机获取高分辨率图像。荧光图像使用ET560/40x–ET630/75m滤光片组捕获，曝光时间为600 ms。使用ZFBONE工具集在Fiji/ImageJ软件中分析头部区域的侧面图像。通过“鳃盖分析”工具和多边形选择工具，在荧光对比下使用地标手动勾勒鳃盖区域。通过测定鳃盖面积与头部面积的比率来计算归一化的鳃盖面积。
2.7. 形态学分析 进行形态测量分析以确定处理是否对生长产生影响，通过评估幼虫的总体长度和身体曲率角度。在6 dpf时，用表中列出的化合物、每种化合物显示骨生成活性的最低浓度以及阴性对照（DMSO和乙醇）处理幼虫，进行麻醉和侧向成像用于测量。每个处理组使用三个生物学重复，每组5条幼虫。如前所述获取图像，并在标准化成像条件下：光学变焦2.0×，增益2.4，曝光时间192.41 ms。使用Fiji/ImageJ中的“直线”工具，用连续的直线段描绘身体并求和其长度来测量幼虫总长度。使用Fiji/ImageJ中的“角度”工具测量曲率角度，沿身体轴追踪三个点：一个在头部前端，一个在脊索最大曲率点，一个在尾部后端。测量内角作为曲率角度。
2.8. 行为分析 使用6 dpf的斑马鱼幼虫测定实验暴露于化合物后的行为改变。测试八个处理组（YB1, YB9, YB11, YB17, T2, IC22, IC26, IC33）和两个阴性对照组（DMSO和乙醇），使用每种化合物显示骨生成活性的最低浓度。每组进行三次重复，每次重复15条幼虫。将单条幼虫添加到标准24孔板的每个孔中，孔内含有2 mL系统水。允许平板有10分钟的适应期以减少处理应激和多动。适应后，将平板加载到Zantiks MWP自动测试单元中，在恒定光照下（即100 lux白光）跟踪运动行为5分钟。Zantiks跟踪软件在5分钟的试验期间每秒记录每条幼虫的x-y坐标。原始跟踪数据存储为包含每个个体的时间戳坐标值的CSV文件。运动行为量化为每条幼虫移动的总距离（像素），作为连续坐标之间的累积距离。像素距离被用作运动活动的替代指标。
2.9. 标记基因的表达 从每种实验条件下收集6 dpf幼虫的三个重复，每组15条，使用NZYol提取总RNA。在NanoDrop OneC分光光度计上分析RNA纯度和浓度。一微克总RNA用RQ1无RNase的DNase处理，随后使用MMLV-RT和 oligo(dT)-adapter primer进行反转录。然后使用10 ng cDNA、基因特异性引物和SensiFAST? Probe No-ROX Kit进行实时定量PCR（qPCR）。在CFX96热循环仪上进行扩增反应。使用2-ΔΔCt方法计算相对转录本丰度。为了选择用于qPCR分析标准化的稳定表达的内参基因，测试了三个广泛使用的管家基因的表达水平：18S核糖体RNA（18s）、β-肌动蛋白（β-actin）和延伸因子1-α（ef1α）。18S核糖体RNA在这些实验条件下表现出最稳定的表达，因此被选为qPCR基因表达分析标准化的管家基因。
对于通过qPCR进行的基因表达分析，使用暴露于三种测试化合物（IC22、YB1和YB17，在每种化合物显示骨生成活性的最低浓度下）和阴性对照（DMSO）的幼虫的cDNA。定量了氧化应激反应标记基因（即过氧化氢酶, cat; 超氧化物歧化酶1, sod1）和骨骼与骨骼肌发育标记基因（即osterix, sp7; 骨钙素2, oc2; 肌浆/内质网Ca2+-ATPase 1, atp2a1; 碱性磷酸酶, 与生物矿化相关, alpl; 胶原蛋白, I型α1a, col1a1a; runt相关转录因子2b, runx2b）的表达水平。所有qPCR实验均使用生物学重复（n=3）重复三次。
2.10. 统计分析 使用Prism软件进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。使用Anderson–Darling检验评估数据正态性。通过单因素方差分析（ANOVA）后接Kruskal–Wallis检验多重比较检验或非配对t检验评估组间差异。统计显著性使用标准星号表示法表示：p<0.05（），p<0.01（），p<0.001（），p<0.0001（**）。
3. 结果
3.1. 内过氧化物的毒性和LC50 结果显示，在不同测试的青蒿素衍生内过氧化物中，导致50%群体死亡的致死有效浓度（LC50）差异相当大，YB2和T2表现出更高的毒性，LC50值最低，分别为5和5.2 μM，而IC26表现出最高的LC50值，为74.4 μM。尽管本实验中评估的所有浓度均低于各自的LC50值，但在最高测试浓度下仍观察到死亡率，尽管死亡率未达到50%。
3.2. 矿化评估 为确定合成的内过氧化物化合物的骨生成效应，我们在斑马鱼幼虫上进行了鳃盖分析，幼虫从3 dpf暴露到6 dpf。将鳃盖面积归一化，考虑每条幼虫的头部面积，并比较不同药物治疗的结果，以DMSO或乙醇作为阴性对照，骨化三醇作为阳性对照。
正如预期，骨化三醇处理在所有实验中均诱导鳃盖面积相对于阴性对照增加。YB1处理对鳃盖形成具有剂量依赖性效应。在6和30 μM YB1下，幼虫的鳃盖面积与阴性对照相比显著减少，这与抗骨生成效应一致。相应的非过氧化对照IC22在较低浓度（1和4 μM）下相对于阴性对照对鳃盖面积无显著影响，但较高浓度（20和30 μM）诱导矿化鳃盖显著减少。以盐形式测定的YB17也显示出对鳃盖的抑制活性。在所有测试浓度下均观察到矿化鳃盖面积的统计学显著减少。中性醚对照IC26仅在较高测试浓度下诱导抗骨生成效应。YB11在6和30 μM时相对于阴性对照显著抑制鳃盖生长。IC33仅在较高浓度下抑制矿化。T2在2 μM和5 μM时诱导鳃盖面积相对于阴性对照统计学显著减少。YB9在8 μM时诱导鳃盖面积相对于阴性对照统计学显著减少，但在较低浓度下没有。
3.3. 形态学评估
3.3.1. 幼虫长度 在对照组中，幼虫的平均总长度为4.0-4.2 mm。用所有测试化合物处理的斑马鱼幼虫与对照组相比，生长没有差异。
3.3.2. 身体曲率 对照组幼虫的身体曲率角度值接近170°，反映了正常的身体轴线排列。相比之下，IC26诱导了一种以过度身体曲率为特征的表型。受影响的幼虫表现出躯干角度增加，这是发育毒性或神经肌肉功能障碍的特征。IC33也导致身体曲率增加，大于对照，并且变形比IC26观察到的更严重。其他内过氧化物（YB9, YB17, T2）在测试浓度下未引起身体形状的显著改变，表明形态得以保留。暴露于所有化合物后，与DMSO处理的对照幼虫相比，用IC33和IC26处理的组中的幼虫畸形尤其明显。这些畸形通过测量身体轴线角度的偏差来评估，我们在IC33组中观察到幼虫明显的弯曲，在IC26组中观察到中等弯曲。
3.4. 行为测试 为了更仔细地研究与暴露于测试化合物后观察到的身体曲率改变相关的潜在系统或神经毒性副作用之一，我们评估了6 dpf幼虫的运动活动，通过测量行为测试过程中移动的距离。所有组均归一化到其各自的阴性对照。本实验中使用的浓度是鳃盖分析中观察到抗骨生成效应的最低浓度。
正如预期，阴性对照组提供了强烈的运动反应，平均距离为250-350像素，这些被用作比较标准。关于所研究的合成化合物，暴露于醚IC26在60 μM时产生运动活性抑制，因为幼虫游动的距离显著短于用DMSO处理的幼虫。值得注意的是，暴露于四噁烷YB11在6 μM时导致运动抑制，幼虫显示出几乎完全停止游泳活动。暴露于四噁烷T2在2 μM和醚IC33在40 μM时也显示出运动活性的统计学显著减少，尽管程度较轻。暴露于YB1在6 μM、IC22在20 μM、YB17在0.5 μM和YB9在8 μM时，与阴性对照相比，未影响运动。
3.5. 基因表达分析 评估了选定的标记基因atp2a1、runx2b、col1a1a、alpl、oc2、sp7、sod1和cat在6 dpf斑马鱼幼虫中的相对表达水平，这些幼虫经过四噁烷YB1（6 μM）、YB17（0.5 μM）和一种对照类似物醚IC22（20 μM）处理。
选择用于基因表达分析的、仅显示骨生成效应的化合物处理，被证明在暴露的斑马鱼幼虫中诱导了与肌肉骨骼发育和氧化应激反应相关的标记基因表达水平的显著改变。YB1处理导致atp2a1显著下调，该基因参与钙转运；runx2b下调，这是成骨细胞分化的关键调节因子；col1a1a下调，这是斑马鱼幼虫中胶原基质形成的主要结构基因；oc2下调，这是成熟成骨细胞的标记物；以及cat下调，这是与抗氧化防御系统相关的基因。alpl的表达保持不变，该基因参与成骨细胞成熟和矿化，以及未成熟成骨细胞标记物sp7的表达也保持不变。YB1处理导致sod1上调，这是另一个与抗氧化防御系统相关的基因。YB1的非过氧化类似物IC22导致atp2a1、runx2b、col1a1a、oc2、sp7和cat的强烈下调，但未影响alpl和sod1的表达。内过氧化物骨架的盐形式YB17诱导col1a1a和alpl下调，并诱导atp2a1和oc2上调。
3.6. 总结 在表型水平上，YB1、YB17和IC22在骨生成分析中诱导了效应，但在行为、幼虫长度和身体曲率方面没有观察到变化。这与筛选的其他分子（例如IC26、YB11、IC33、T2、YB9）形成鲜明对比，在这些分子中观察到各种毒性效应，例如运动活动受损、幼虫生长减少和形态异常增加。YB1、YB17和IC22的选择性抗骨生成效应，而不诱导系统发育毒性，使得这三种分子成为未来研究中最有希望的候选分子。
4. 讨论
总的来说，我们的研究结果表明，青蒿素衍生的1,2,4,5-四噁烷以及几种无过氧化物的对照分子在斑马鱼幼虫中表现出抗骨生成活性和毒性，提供了这些化合物具有致畸性的证据。其他青蒿素衍生分子也有致畸效应的报道。青蒿素衍生物干扰钙稳态已有充分记载；然而，据我们所知，这是首次报道通过已建立的鳃盖分析和参与钙调节的基因表达分析来评估钙失衡对骨骼影响的研究。
所有测试的内过氧化物（YB1, YB9, YB11, YB17, T2）和非过氧化对照化合物（IC22, IC26, IC33）都显示出明确的抗骨生成活性，尽管具有可变的剂量-反应曲线。非过氧化对照化合物IC22和IC33在比相应的过氧化化合物YB1和YB11更高的剂量下显示出抑制作用。这表明分子结构中过氧键的存在很可能与抑制骨生成活性有关，正如在斑马鱼幼虫矿化鳃盖的形成中所观察到的。另一方面，类似物IC26在测试浓度下表现出比母体盐YB17更高的抗骨生成活性。然而，这种差异可能是由于化合物的浓度不同，相差120倍。有趣的是，酰胺功能化的内过氧化物T2和YB9在相对较低的浓度下表现出较高的抗骨生成活性，表明酰胺官能团可能是活性和毒性的重要决定因素。
在用缺乏过氧键的对照分子（如IC26和IC33）处理后，观察到了显著的畸形，特别是弯曲的躯干。根据文献，几项研究描述了用青蒿素及其衍生物处理后由于致畸效应导致的形态学改变。尽管用IC26和IC33处理改变了身体曲率角度，但它们不影响幼虫的总长度。这些发现表明，缺乏过氧键的对照分子可能通过过氧化物非依赖的机制在斑马鱼幼虫中发挥毒性和致畸效应，可能与它们的冠醚结构和生物体内的代谢途径有关。更深层次的结构分析以及进一步的生物学研究可能阐明所涉及的可能机制。
鉴于形态畸形可能导致异常行为，例如运动减少，我们观察到运动活动不仅被IC26和IC33抑制，还被1,2,4,5-四噁烷YB11和T2抑制。这些结果表明，行为效应不仅仅依赖于过氧键的存在或缺失，指出可能由这些化合物的其他结构特征诱导的其他机制，这些特征影响了它们与生物体特定生物分子靶标的相互作用，或与其他因素（如吸收和/或代谢能力）的相互作用。
几项研究表明青蒿素及其衍生物影响SERCA活性，这从观察到的细胞内钙水平失调中得到证明。在我们的研究中，我们想要直接研究SERCA蛋白表达。已知青蒿素及其衍生物抑制PfATP6，该基因编码疟原虫中的P型Ca2+
