《Microbiology Spectrum》：Dairy manure, glyphosate, and antimicrobials (copper, streptomycin, and triazole) modulated the composition of antimicrobial resistance at the gene and microbial levels in a processing tomato field
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为应对农业实践中广泛使用的农药和有机肥对农田生态系统抗微生物耐药性(AMR)发展的潜在影响，本研究评估了乳牛粪、草甘膦、铜、链霉素和丙环唑对番茄田可培养AMR细菌(CARB)、AMR基因(ARGs)及微生物组的综合效应。研究发现，这些农用投入品显著改变了土壤和叶际微生物组，并重塑了ARGs的图谱，表明除草剂和杀菌剂的使用可能与常规抗菌剂一样，在促进AMR的发生与传播中扮演重要角色。该研究为理解农业实践如何加剧环境AMR负担提供了关键证据，对食品安全和可持续农业具有重要警示意义。
在追求粮食高产稳产的道路上，现代农业广泛依赖各种“外援”——化学农药、兽用抗生素、有机肥料。它们虽然守护了农作物，却也带来了一个看不见的战场：土壤和植物表面微小的细菌们，正在“武装”自己。当这些细菌对抗生素、重金属乃至除草剂产生抵抗能力，医学上至关重要的“最后一招”可能因此失效。这就是抗微生物耐药性(AMR)，一个被世界卫生组织列为全球十大健康威胁之一的难题。农业生态系统，特别是像番茄这样常常生食、高投入的作物系统，被认为是AMR发生和传播的关键“温床”。然而，农民们同时使用的多种农用化学品（如除草剂草甘膦、杀菌剂丙环唑、铜基杀菌剂）以及富含细菌的动物粪便，它们之间如何“联手”或“对抗”，共同影响农田中的细菌群落和耐药基因图谱，我们知之甚少。为了回答这个复杂的问题，一组研究人员在美国俄亥俄州立大学CFAES-Wooster校区的一块加工番茄田中，开展了一项精细的田间试验，相关成果发表在期刊《Microbiology Spectrum》上。
研究人员设计了一个包含16种农艺措施组合、共64个试验小区的随机区组试验。主要技术方法包括：在不同时间点施用挤压乳牛粪和草甘膦作为种植前处理，并在番茄生长季每周叶面喷施链霉素、氢氧化铜或丙环唑。研究团队在九个时间点（TP1-TP9）系统采集了土壤和番茄叶片样本。通过将样本在添加了铜、链霉素、头孢吡肟、头孢西丁和美罗培南的MacConkey琼脂上直接涂布，定量了可培养的AMR细菌(CARB)。利用针对87个ARGs的qPCR阵列分析了抗生素耐药基因的组成。通过对16S rRNA基因V4-V5区进行MiSeq测序，并结合QIIME 2分析流程，解析了土壤和叶片微生物组的结构与多样性。此外，还通过流式细胞术估算了土壤总微生物数量，并通过液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)检测了土壤中链霉素的残留。
Impact of manure and glyphosate on the abundance of CARB in the soil and tomato leaves collected before the growing season (TP1–TP6)
研究发现，初始土壤(TP1)已含有高水平的CARB。施用的乳牛粪本身携带的CARB水平显著高于土壤，尤其是对铜和链霉素耐药的细菌。但在施用后86天(TP3)，粪肥处理区土壤CARB水平与未处理区无显著差异。相比之下，草甘膦处理在施用后3天(TP4)显著增加了土壤中总CARB水平，特别是对铜和美罗培南耐药的细菌，但这种增加是短暂的。在番茄定植后(TP6)，草甘膦处理地块的叶片中链霉素和铜耐药细菌水平高于对照。
Impact of agricultural practices on the abundance of CARB present in the soil and tomato leaf tissues collected during the growing season (TP6 to TP9)
生长季的分析表明，CARB的丰度主要受种植前施用的乳牛粪和草甘膦影响，而生长期叶面喷施的农药起次要的修饰作用。在叶片中，这种趋势更为明显。例如，在第一次农药施用后6天(TP7)，草甘膦处理地块叶片中的链霉素耐药细菌水平显著更高。到第四次农药施用后(TP8)，所有仅施用草甘膦的地块CARB水平最低，而大多数粪肥处理地块CARB水平最高。铜、丙环唑和链霉素的施用也分别影响了微生物群落的聚类模式。
Effects of dairy manure and glyphosate on soil total microbial load
在TP6和TP7，同时施用粪肥和草甘膦(GM组)的地块，其土壤总微生物负载量低于单独施用草甘膦或粪肥的地块。然而，GM组中CARB的相对丰度（占总微生物的比例）却显著更高，表明这些处理选择性地富集了耐药细菌。
Impact of agricultural practices on the ARG composition in soil and tomato leaves
在检测的87个ARGs中，共有48个在样本中被检出。粪肥和/或草甘膦处理显著增加了叶片中某些ARGs类别的流行率。例如，在叶片中，C类β-内酰胺酶基因在GM和M组的流行率(91%)高于G组(45%)。土壤中，M和GM地块的ARGs流行率有更高的趋势。而生长期喷施抗菌剂(Cu, St, Tr)的叶片，其ARGs流行率普遍低于未喷药对照。从TP6到TP9，土壤和叶片中的ARGs多样性均有所增加。在TP9，GM组土壤中的ARGs数量显著多于其他组，而链霉素处理土壤中的ARGs数量多于铜或丙环唑处理组。
Effects of agricultural practices on soil and leaf microbiomes
土壤微生物组以变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门为主，叶片微生物组则以蓝藻门和变形菌门为主。草甘膦处理，特别是与粪肥联用时，在TP4显著降低了土壤微生物的α多样性（Faith PD和Shannon指数）。在生长季，粪肥处理地块的微生物多样性最高，而草甘膦和铜处理地块的多样性最低。在TP6（首次施药前）到TP7（首次施药后）期间，土壤微生物组发生了显著转变，拟杆菌门相对丰度降低，而厚壁菌门、绿弯菌门等的相对丰度增加。
Correlations between the microbiome and ARG profiles
在760个扩增子序列变异(ASVs)中，有144个（19%）与ARGs的丰度呈正相关，但土壤和叶片中的相关模式不同。土壤中有112个ASVs与34个ARGs正相关，主要涉及氨基糖苷类、氟喹诺酮类、β-内酰胺酶类等耐药基因，这些ASVs多属于变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。叶片中有26个ASVs与14个ARGs正相关，主要涉及大环内酯类和β-内酰胺酶类基因，这些ASVs多属于变形菌门和拟杆菌门。
Antimicrobial residues in soil
LC-MS/MS分析显示，在首次施用链霉素后6天(TP7)，土壤中可检测到链霉素残留(0.033±0.004 ppm)，在第五次施用后6天(TP9)，残留水平显著升高至0.15±0.03 ppm。铜残留浓度在所有地块（包括未处理地块）的整个试验期间保持稳定，处理地块浓度虽高于未处理地块，但未观察到累积效应。
Repeated antimicrobial applications did not alter the physico-chemical properties of soil
尽管土壤的理化性质随时间发生变化（如TP7的磷、钠、钾、有机质和游离氮含量较高），但不同的农艺措施处理并未对土壤理化性质产生 distinct 影响。
结论与讨论
本研究清晰地表明，单个农艺措施对加工番茄系统AMR组成的影响可能有限，但它们的组合能够显著改变CARB和ARGs的丰度与多样性。乳牛粪的施用持续增加了土壤和番茄叶片中CARB的水平和多种ARGs的流行率，证实了粪肥作为AMR储存库和扩散源的重要角色。草甘膦在施用初期短暂提升了土壤CARB，但在生长季后期却与叶片中较低的CARB和ARGs水平相关，显示出其对叶际细菌可能的抑制作用。然而，当草甘膦与粪肥联合施用时，粪肥的影响占主导地位，导致了最高的土壤ARGs和叶片中氨基糖苷类耐药基因流行率。特别值得注意的是，杀菌剂丙环唑和抗生素链霉素的处理，与叶片中最低的ARGs流行率相关，这提示某些农用化学品可能对叶际耐药基因组产生抑制作用，其机制值得深入探究。
这项研究的意义深远。它首次在田间尺度上，系统评估了包括除草剂、杀菌剂、重金属和有机肥在内的多种常见农用投入品对番茄这一重要生食作物系统中AMR格局的联合影响。结果证明，非抗生素类农药（如草甘膦和丙环唑）能够像传统抗菌剂一样，显著影响农田生态系统的微生物组和耐药基因图谱。这极大地拓宽了我们对农业AMR驱动因素的理解。从“一体化健康”视角看，农田中产生的耐药细菌和基因，可以通过食物链（如生食番茄）、水系统或气溶胶等途径传播，最终威胁人类健康，限制临床治疗选择。因此，该研究呼吁在农业管理中采取更审慎、综合的策略，例如探索粪肥的无害化处理替代方案、开发生物防治等非化学防控手段、以及采用精准施药技术，以减轻AMR的扩散风险，保障植物健康、食品安全和公共健康。未来的研究需要在更多作物体系和更长的时间尺度上，进一步验证这些相互作用，并深入揭示其背后的分子生态学机制。
