《Microbiology Spectrum》：Evaluation of multiple extraction and inactivation methods for the rapid identification of filamentous fungi using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
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本研究针对MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）应用于临床丝状真菌快速鉴定时存在的生物安全问题与操作流程复杂性问题，系统评估了一种利用甲酸进行灭活和蛋白提取的“MyT”（菌丝体转移）方法。研究通过前瞻性比较，发现该免提取方法不仅可高效灭活真菌孢子，显著提升实验室生物安全性，且在物种水平和属水平鉴定准确率、光谱评分方面均显著优于常规提取方法。该研究为临床微生物实验室将丝状真菌鉴定安全、快速、有效地整合进常规工作流程提供了有力证据和实践方案，对优化感染诊断和治疗决策具有重要意义。
在自然界中无处不在的丝状真菌，是免疫功能低下人群中最主要的临床相关真菌病原体之一。据全球流行病学数据估算，每年约有650万例侵袭性真菌感染病例，并导致约380万人死亡。传统依靠菌落宏观形态和显微特征进行表型鉴定的真菌诊断方法，不仅耗时费力，其结果也易受观察者主观差异影响。随着基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）技术的出现，其在细菌和酵母菌鉴定领域已取得革命性进展，人们开始探索将其应用于丝状真菌的快速鉴定。然而，该技术在应用于丝状真菌时面临两大核心挑战：一是复杂的样品前处理流程，包括繁琐的蛋白提取步骤，增加了操作时间和成本；二是潜在的生物安全风险，在处理和接种样本过程中，真菌孢子可能形成气溶胶，对实验室人员构成职业暴露风险，尤其是对于致病力强的内源性双相性真菌。为了应对这些挑战，并推进MALDI-TOF MS在临床真菌诊断中的应用，美国印第安纳波利斯的研究团队在《Microbiology Spectrum》上发表了一项研究，旨在系统评估并比较不同的前处理方法，在确保安全性的同时，实现丝状真菌的快速、准确鉴定。
为开展这项研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法。研究采用了临床真菌样本和来自美国模式菌种保藏中心的参考菌株，共涉及42种独特的丝状真菌物种。在生物安全验证方面，设计了一项为期4周的前瞻性灭活研究，在生物安全柜内操作，对每种菌株在液体和固体培养基上进行三次重复实验，评估“菌丝体转移”（Mycelium Transfer, MyT）方法的灭活效果。在鉴定性能评估方面，研究人员系统比较了三种MALDI-TOF MS前处理方案：基于甲酸预处理的MyT方法、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）的快速提取法和美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）的快速提取法。每种方法均在常规培养基和特殊的产孢真菌板（ID Fungal Plates, IDFP）上进行评估。质谱分析在布鲁克MALDI Biotyper质谱仪上完成，并使用布鲁克MBT Compass软件和RUO HT Filamentous Fungi CA模块进行分析。统计学分析采用Prism软件，通过Kruskal-Wallis和Dunn多重比较检验评估不同方法间MALDI-TOF MS评分的差异。
灭活研究
研究人员对所有42株丝状真菌的灭活效果进行了评估。在为期28天的孵育期内，绝大多数菌株在液体和固体培养基中均未观察到突破性生长（表现为“-/-/-”模式）。仅有4/42（9.5%）的菌株出现了初始突破性生长，包括在液体肉汤中于第2周出现突破生长的紫红紫孢霉（Purpureocillium lilacinum）和荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum），在固体培养基上于第1周出现突破生长的球黑孢霉（Nigrospora sphaerica），以及一种在液体肉汤中于第3周出现持续性突破生长的毛癣菌（Trichophyton spp.）。经过重复接种验证，除该毛癣菌株外，其余三株菌的突破性生长问题均得以解决，最终仅1/42（2.4%）的菌株在多次重试后仍有持续生长。这表明，MyT方法能有效灭活绝大多数受试真菌菌株，为实验室操作提供了重要的安全基础。
MALDI-TOF性能
研究人员通过MALDI-TOF MS光谱评分对不同方法和培养基的鉴定性能进行了全面评估。结果显示，MyT方法在真菌鉴定成功率上表现最优。在常规培养基上，其成功鉴定率为90.5%，显著高于NIH提取法（61.9%）和CDC提取法（66.7%）。当使用IDFP特殊培养基时，MyT方法的成功率进一步提升至92.9%。MyT方法在物种水平鉴定比例（常规培养基61.9%，IDFP 69.1%）和平均鉴定评分（常规培养基2.03，IDFP 2.06）方面也均是最高的。对六种方法迭代的统计学比较发现，仅有MyT（IDFP）方法与CDC提取法（常规培养基）及CDC提取法（IDFP）之间存在显著差异（P值分别为0.0421和0.0049）。将真菌按临床/真菌学分类进行分层分析后发现，MyT方法获得了最高的平均评分，并且是唯一能够对特定临床组实现100%鉴定的方法（在常规培养基上可100%鉴定所有皮肤癣菌和毛霉目真菌，在IDFP上可100%鉴定所有暗色真菌、皮肤癣菌和毛霉目真菌）。IDFP的使用显著提升了MyT方法和NIH提取法的鉴定准确性，但CDC提取法在使用IDFP时，其准确率和平均评分反而有所下降。有3株真菌在六种方法迭代中均未能被稳定鉴定，包括一株透明丝孢霉（Fusarium equiseti）和两株双相性真菌（Coccidioides immitis和Coccidioides posadasii），后者的失败被归因于研究中使用的数据库中缺乏球孢子菌属的谱图信息。
本研究评估了将MALDI-TOF MS用于丝状真菌快速鉴定的可行性与安全性，特别关注了实验室生物安全这一关键问题。结果显示，所评估的MyT（菌丝体转移）方法，作为一种免提取方案，在绝大多数受试真菌中表现出优异的灭活效果，有效降低了实验室人员在处理高致病性真菌（特别是双相性真菌）时的暴露风险。在鉴定性能方面，MyT方法在物种水平鉴定准确率、光谱评分和总体成功率上均显著优于另外两种快速提取法。使用特殊的产孢真菌板（IDFP）可进一步提升鉴定性能，但其带来的边际效益需与其额外成本进行权衡。研究表明，复杂的多步骤提取流程可能导致蛋白质质量下降或稀释效应，而MyT方法直接将所有真菌生物质转移至靶板，可能是其性能更优的原因之一。该研究为临床实验室安全、高效地将丝状真菌鉴定纳入常规MALDI-TOF MS工作流程提供了直接证据。尽管研究存在单中心、样本量有限、仅使用单一质谱平台和数据库等局限性，但MyT方法在确保生物安全的同时，实现了快速、准确的真菌鉴定，并大幅减少了操作时间，为临床真菌感染的快速诊断和治疗决策提供了具有前景的实用方案。
