一种耦合的ADP依赖性葡萄糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定方法，用于量化ATP依赖性激酶的活性

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：A coupled ADP-dependent glucokinase/glucose-6-phosphate dehydrogenase assay to quantify ATP-dependent kinase activity

ATP依赖性激酶定量检测新方法基于ADP依赖性葡萄糖激酶（TlGK）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（LmG6PDH）的耦合系统，通过监测340 nm处NADH生成实现连续定量分析，解决了传统方法底物不稳定、依赖一价离子等问题，并建立了数学模型优化辅助酶用量。

　　

Martin Pereira-Silva|Nicolás Fuentes-Ugarte|Victoria Guixé|Victor Castro-Fernandez

智利大学理学院生物学系生物化学与分子生物学实验室，Las Palmeras 3425，圣地亚哥 – 智利。邮政编码 7800003

摘要

ATP依赖性激酶在代谢和细胞调控中起着核心作用，因此对其精确量化对于生化及动力学研究至关重要。传统的耦合测定方法在测量ATP依赖性激酶活性时存在技术限制，包括辅助酶底物的不稳定性、对单价离子的依赖性以及需要检测辅因子的消耗。本文描述了一种基于来自Thermococcus litoralis的ADP依赖性葡萄糖激酶(TlGK)与来自Leuconostoc mesenteroides的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(LmG6PDH)耦合的替代测定方法，该方法能够实现ATP依赖性激酶活性的定量和连续监测。

该测定方法依赖于辅助酶TlGK和LmG6PDH，这两种酶均为重组生产，并在pH 7.0和25 °C条件下进行了动力学表征。在此系统中，激酶反应产生的ADP用于生成葡萄糖-6-磷酸，后者进一步氧化生成NADH，从而可以在340 nm处进行直接的分光光度监测。系统地分析了Mg–ATP复合物对测定性能的影响，明确了抑制的动力学机制，这对耦合测定的实验设计具有重要意义。

通过使用顺序耦合反应的动力学模型，我们建立了一个通用数学框架，以估算确保稳态条件并维持测定分析有效性所需的辅助酶的最小量。该方法使用ATP依赖性激酶ThiD进行了实验验证，结果表明测得的初始速率与辅助酶浓度无关，且与激酶活性成正比。这些结果共同构建了一个动力学框架，并提供了一种多功能的ATP依赖性激酶活性定量测定方法。

引言

激酶（EC 2.7.X.X）是存在于所有生命域中的酶[1]，属于转移酶类，它们催化磷酸基团从供体分子（通常是ATP）转移到受体分子上，生成磷酸化产物，同时通常会产生ADP[2]。这些反应需要二价离子（如Mg²⁺）的存在，并可根据磷酸受体分子的类型（例如核苷酸、脂质、蛋白质等）进行分类[3],[4]。

激酶催化的磷酸基团转移在真核细胞和原核细胞的多种代谢过程中发挥着基础性作用[5],[6],[7]，通过调节代谢控制点或通过磷酸化蛋白质来发挥作用，成为能量平衡、营养感应和细胞稳态的关键调节因子[8]。此外，激酶作为重要的治疗靶点，因为它们调控着人类的基本细胞过程，在癌症和神经退行性疾病中起着关键作用[8],[9]，参与生长、增殖和分化等过程[10],[11]。

鉴于激酶在制药领域的重要性，对其酶活性的分析测量和实时监测变得极为重要，因此已经开发出了多种定量激酶活性的分析方法[9]。这些方法包括使用放射性标记的ATP（γ-³²P），该方法可以直接量化磷酸基团的转移[12]。然而，直接检测磷酸化产物、测量ATP消耗量和量化ADP生成量的方法仍然是监测激酶活性最常用的策略[10],[13]。在这些方法中，荧光法和分光光度法能够实现ATP和ADP之间交换的连续量化[13],[14]。基于耦合酶的测定方法能够实现对反应的连续监测，因此在动力学研究中得到广泛应用[15]。

最常用的耦合系统是丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶（PK/LDH）测定法。在此系统中，丙酮酸激酶将ADP和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为ATP和丙酮酸[16]。生成的丙酮酸随后被乳酸脱氢酶还原为乳酸，同时NADH被氧化为NAD⁺。340 nm处吸光度的下降反映了NADH的氧化，利用6.22 mM^-1·cm^-1的摩尔消光系数可以间接量化ADP的生成速率[16]。

然而，该系统存在一些技术限制。例如，肌肉中的丙酮酸激酶需要单价离子（特别是K⁺），这引入了额外的变量[17],[18]。此外，磷酸烯醇式丙酮酸是一种化学不稳定的化合物，其高能烯醇基团容易发生非酶促水解和自发互变异构为酮式，从而增加实验结果的变异性[19]。最后，基于NADH吸光度下降的测定方法监测的是底物的消耗而非产物的生成。实际上，从较大的初始信号中量化变化在分析上更具挑战性，且更容易受到基线波动的影响，相比之下，直接检测340 nm处的NADH出现更为可靠。此外，反应混合物中的化合物可能对NADH进行非特异性氧化，产生假阳性信号，影响激酶活性的准确测定[20]。

为克服这些限制，报道了一种用于测定ATP依赖性激酶活性的替代耦合酶测定方法。该方法基于ADP依赖性葡萄糖激酶（GK）与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的耦合，称为GK/G6PDH系统（US7816099B1）[21]。在该系统中，ATP依赖性激酶反应产生的ADP作为底物，被GK用来磷酸化葡萄糖（Glc）生成葡萄糖-6-磷酸（G6P）。随后，G6PDH催化G6P氧化为6-磷酸葡糖酮内酯（6-PGL），这一反应与NAD⁺还原为NADH的过程耦合，可以在340 nm处进行分光光度监测[22]（图1）。

与PK/LDH方法相比，该系统具有显著优势：使用葡萄糖作为辅助酶的底物，葡萄糖是一种化学性质稳定、易于实验操作的化合物；同时可以直接量化NADH的生成，减少了非特异性辅因子氧化带来的干扰。此外，该系统不依赖单价离子的存在，简化了实验设计并扩展了其应用范围。

然而，尽管有这些优势，GK/G6PDH系统的特性研究仍然不足。迄今为止，仅有报道使用来自超嗜热古菌Thermococcus litoralis的ADP依赖性葡萄糖激酶与来自中温酵母Saccharomyces cerevisiae的G6PDH耦合的研究[22]。在该研究中，该系统未经过全面的动力学表征，也未系统评估测定过程中底物可能产生的抑制效应。

不过，基于GK/G6PDH的系统已用于Chaetomium thermophilum中的甘油激酶的表征[23]，并且改进版的GK/G6PDH系统结合荧光读数技术实现了ADP生成的连续监测[14]。

本文报道了基于来自超嗜热古菌Thermococcus litoralis的ADP依赖性葡萄糖激酶(TlGK)和来自中温细菌Leuconostoc mesenteroides的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(LmG6PDH)的耦合GK/G6PDH酶系统的表征和标准化。尽管< />GK是一种嗜热酶，但测定过程仍按照常用的激酶活性测定条件（pH 7.0和25 °C）进行标准化。为此，我们使用了属于维生素激酶家族的ThiD酶，该酶可以磷酸化4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶（HMP）和4-氨基-2-甲基-5-磷酸氧甲基嘧啶（HMP-P），同时具有羟甲基嘧啶激酶（HMPK，EC 2.7.1.49）和羟甲基嘧啶磷酸激酶（HMPPK，EC 2.7.4.7）的活性[24],[25],[26]。此外，还评估了潜在调节因子对耦合测定系统的影响，包括Mg–ATP复合物对ADP依赖性葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制作用。

我们还评估了潜在调节因子对耦合测定系统的影响，包括Mg–ATP复合物对这两种酶的抑制作用。此外，利用动力学模型[27]确定了在Mg-ATP存在下保证稳态条件和确保测定分析有效性的最小酶用量。

部分内容片段

纯化 LmG6PDH和TlGK 重组酶

重组蛋白在大肠杆菌中表达，并通过Ni–NTA亲和层析法成功纯化，得到了高纯度的产物（SDS–PAGE验证，见图S1）。从2 L培养物中纯化了约208 mg的LmG6PDH，比活性为500 U/mg（见图S1B），表明表达效率较高。对于TlGK，在Ni–NTA亲和层析之前还进行了70 °C的热处理。

重组酶的表达与纯化

编码来自Thermococcus litoralis的ADP依赖性葡萄糖激酶(TlGK；UniProt Q7M537)、Leuconostoc mesenteroides的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(LmG6PDH；UniProt P11411)以及ThiD激酶（PDB ID 7R8Z）[24]的基因经过密码子优化后，用于大肠杆菌的表达，并由GenScript（美国新泽西州Piscataway）公司合成。每个基因都被克隆到pET-TEV-28a表达载体中，带有N末端His₆标签和卡那霉素抗性。

重组质粒随后被转化进宿主细胞

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CRediT作者贡献声明

Nicolás Fuentes-Ugarte：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、概念构思。Martin Pereira-Silva：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、调查、形式分析。Victor Castro-Fernandez：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金申请、数据分析、概念构思。Victoria Guixé：撰写 – 审稿与编辑

资助

本项工作得到了FONDECYT（编号1221667，V.C-F.）和FONDECYT（编号1231263，V.G.）的支持。此外，还获得了ANID国家博士奖学金（编号21221449，N.F-U.）的资助。