配备致命毒素的效应细胞，有望用于癌症治疗

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Lethal toxin–equipped effector cells for the potential treatment of cancer

【字体：大中小】 时间：2026年03月18日 来源：Proceedings of the National Academy of Sciences 9.4

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　　靶向癌症的免疫毒素递送系统通过基因编辑增强效应细胞抗性，实现精准杀伤

摘要

致命毒素可能成为对抗癌症的有效疗法，但其临床应用受到全身给药时不良事件的限制。如果这些毒素能够由专门渗透到癌细胞中的效应细胞释放到肿瘤微环境中，那么这些不良事件可能会减少。这一策略面临的一个挑战是，释放毒素的细胞本身必须对这些毒素具有抗性。我们通过研究表明，从经过基因工程改造、对细菌腺苷二磷酸核糖化毒素（ADPRTs）具有抗性的细胞系中提取的效应细胞，可以产生靶向免疫毒素，从而特异性地杀死表达相应肿瘤相关抗原的癌细胞。我们通过敲除二硫胺生物合成途径（DPH1-4）中的基因（这些基因对于ADPRTs作用的真核生物延长因子2（EEF2）的翻译后修饰是必需的），或者直接突变EEF2本身，实现了对免疫毒素的抗性。我们证明了对抗ADPRTs的抗性对于使效应细胞线发挥强大功能至关重要，因为ADPRTs是作用于人类细胞的最强效毒素之一。这项工作为赋予效应细胞向癌细胞输送强效毒素的能力奠定了关键基础，并为进一步研究将其应用于自体或异体治疗细胞类型提供了平台。

效应细胞（如嵌合抗原受体（CAR）T细胞）在肿瘤中局部分泌免疫毒素（ITs）可以减少全身毒性，同时能够杀死抗原异质性的肿瘤细胞、基质细胞和血管细胞（1–5）。来自细菌ADPRTs的ITs，包括白喉棒状杆菌的外毒素A（PE），可以在二硫胺修饰的组氨酸残基H715处催化EEF2的ADP-核糖化。这种翻译后修饰会导致蛋白质合成不可逆地停止并引发细胞死亡（6, 7）。所有人类细胞，包括分泌ITs的效应细胞，都会受到进入细胞质的ADPRTs的影响。先前的研究仅描述了通过自发突变或在非抗性免疫细胞中暂时获得抗性的方法来生产ITs（8, 9）。因此，实施一种明确且可工程化的抗性机制是创建分泌ITs的细胞疗法的重要第一步。在这里，我们描述了如何从经过改造的细胞系（包括Jurkat T细胞）中创建能够分泌具有针对癌细胞特异活性的ITs的效应细胞（图1A）。

图1.

多部分图显示了细胞行为。图表显示了NALM6细胞随时间和浓度的汇合度、相对细胞面积、扩增指数和数量。 — 经过工程改造以抵抗ADPRTs的效应细胞。（A）通过*DPH*基因敲除或*EEF2*突变使效应细胞对ADPRTs具有抗性。（B）293FT细胞经过编辑，破坏了*DPH1-7*（DPH1.KO–DPH7.KO）或引入了突变的*EEF2* p.G717R，并在DT培养环境中生长。细胞汇合度随时间进行了量化。***P < 0.001，通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett检验。（C）Jurkat T细胞和（D）原代人类T细胞在有无DT的条件下培养。相对细胞面积进行了量化。ns：无显著性；*P < 0.05，通过Kruskal–Wallis检验和Dunn检验。（E）293FT细胞在添加外源性TNFα的条件下培养。细胞汇合度随时间进行了量化。（F–H）原代人类T细胞与CD19+ NALM6靶标B细胞和CD19_CD3双特异性T细胞结合物（BsAb）共培养。（F）T细胞扩增指数，（G）上清液中的IFNγ分泌量，以及（H）在第7天的NALM6细胞数量进行了量化。ns：无显著性；*P < 0.05，通过Kruskal–Wallis检验和Dunn检验。

结果

我们使用CRISPR/Cas9破坏了293FT细胞中的二硫胺生物合成途径相关基因，具体包括DPH1、DPH2、DPH3、DPH4、DPH5、DPH6或DPH7。作为一种正交方法，我们使用CRISPR/Cas9同源定向修复在EEF2基因位点引入了p.G717R突变。这一突变消除了附近H715位置的二硫胺修饰（10）。接下来，我们用外源性DT处理这些经过基因改造的293FT细胞并测量了细胞生长情况。破坏DPH1、DPH2、DPH3或DPH4基因，或EEF2 p.G717R突变，使细胞完全抵抗DT（图1B）。在人类T细胞系（Jurkat）（图1C）或原代人类T细胞（图1D）中敲除DPH1同样使这些细胞对DT产生抗性。这表明，敲除部分DPH基因以及EEF2 p.G717R突变可以在转化和原代人类效应细胞中赋予ADPRT抗性，而其他基因敲除则会损害细胞活力。

先前的研究表明，破坏二硫胺途径会使细胞容易受到TNFα介导的凋亡（11）。为了评估对TNFα的敏感性，我们将具有抗性的293FT细胞与TNFα共同培养并测量了细胞生长情况（图1E）。与未经过改造的细胞相比，具有ADPRT抗性的细胞在TNFα作用下生长率没有下降。为了进一步评估抗性突变的可能影响，我们在原代人类T细胞中破坏了DPH1、DPH2、DPH3或DPH4基因，或引入了EEF2 p.G717R突变。然后我们将T细胞与CD19+ NALM6 B细胞以及CD19_CD3双特异性T细胞结合物共培养，以诱导T细胞对NALM6靶细胞的杀伤作用。破坏DPH基因或EEF2突变并未阻止T细胞增殖（图1F）、细胞因子产生（图1G）或细胞毒性（图1H）。

在建立了抗性机制后，我们继续评估作为分泌治疗剂的候选IT构建体。为此，我们设计了针对肿瘤相关抗原表皮生长因子受体（EGFR）的候选ITs，使用来自西妥昔单抗的单链可变片段（scFv）或截短的表皮生长因子（tEGF）作为EGFR的配体。这些结合域与来自PE或DT的催化域和转位域的截短毒素变体融合（SI附录）。将IT构建体转染到经过抗性改造的293FT细胞后，我们通过细胞内流式细胞术测量了IT的表达情况。我们观察到所有IT构建体都可以在抵抗ADPRT的293FT细胞中表达（图2A）。当IT构建体转染到非抗性的293FT细胞中时，存活的IT表达细胞减少，表明所有融合毒素都具有催化活性。随后，我们将转染的293FT细胞与含有NCI-H358癌靶细胞的转well板的屏障插入物共培养，或者直接与NCI-H358细胞共培养（图2 B–D和 Movies S1及S2）。为了评估该系统中的其他ITs，我们还测试了结合了替代EGFR靶点scFvs和来自ChxA的ADPRTs的构建体（图2E）（SI附录）。在所有测试的设计中，表达tEGF-PE38的构建体表现出最强的细胞毒性（图2F）。

图2.

九部分图显示了细胞培养实验。图表显示了不同转染构建体和处理条件下的细胞汇合度和面积随时间的变化。 — 经过抗性工程改造的效应细胞能够分泌免疫毒素，从而特异性地杀死癌细胞。（A）经过ADPRT抗性工程改造的293FT细胞被转染以表达IT和控制构建体。显示了表达这些构建体的活细胞百分比。（B–D）经过抗性工程改造的293FT细胞被转染IT后，要么与GFP+ NCI-H358癌靶细胞共培养，要么直接共培养。（B）共培养第5天的示例图像（10倍放大）。（C）量化了转well共培养或（D）直接共培养中的NCI-H358细胞汇合度。（E）抗性293FT细胞被转染第二组毒素构建体后，直接与NCI-H358靶细胞共培养。纵向量化了NCI-H358细胞的数量。（F）在C–E中显示的不同构建体表达的293FT细胞直接共培养时的GFP+ NCI-H358靶细胞面积。*P < 0.05；**P < 0.01，通过Kruskal–Wallis检验和Dunn检验。（G）靶细胞分别与单独的培养基、外源性DT、转染了GFP的Jurkat DPH1.KO效应T细胞或转染了tEGF-PE38的Jurkat DPH1.KO效应T细胞共培养。量化了不同构建体表达的293FT细胞在直接共培养结束时的靶细胞面积。*P < 0.05；**P < 0.01，通过双因素方差分析和Dunn检验。

结果

我们使用CRISPR/Cas9破坏了293FT细胞中的二硫胺生物合成途径相关基因，具体包括DPH1、DPH2、DPH3、DPH4、DPH5、DPH6或DPH7。作为一种正交方法，我们使用CRISPR/Cas9同源定向修复在EEF2基因位点引入了p.G717R突变。这一突变消除了附近H715位置的二硫胺修饰（10）。接下来，我们用外源性DT处理这些经过基因改造的293FT细胞并测量了细胞生长情况。破坏DPH1、DPH2、DPH3或DPH4基因，或EEF2 p.G717R突变，使细胞完全抵抗DT（图1B）。在人类T细胞系（Jurkat）（图1C）或原代人类T细胞（图1D）中敲除DPH1同样使这些细胞对DT产生抗性。这证明了敲除部分DPH基因以及EEF2 p.G717R突变可以在转化和原代人类效应细胞中赋予ADPRT抗性，而其他基因敲除则会损害细胞活力。

先前的研究表明，破坏二硫胺途径会使细胞容易受到TNFα介导的凋亡（11）。为了评估对TNFα的敏感性，我们将具有抗性的293FT细胞与TNFα共同培养并测量了细胞生长情况（图1E）。TNFα暴露并未降低具有工程抗性的细胞的生长率。为了进一步评估抗性突变的可能影响，我们在原代人类T细胞中破坏了DPH1、DPH2、DPH3或DPH4基因，或引入了EEF2 p.G717R突变。然后我们将T细胞与CD19+ NALM6 B细胞以及CD19_CD3双特异性T细胞结合物共培养，以诱导T细胞对NALM6靶细胞的杀伤作用。破坏DPH基因或EEF2突变并未阻止T细胞增殖（图1F）、细胞因子产生（图1G）或细胞毒性（图1H）。

在建立了抗性机制后，我们继续评估作为分泌治疗剂的候选IT构建体。在这个筛选过程中，我们设计了针对肿瘤相关抗原表皮生长因子受体（EGFR）的候选ITs，使用来自西妥昔单抗的单链可变片段（scFv）或截短的表皮生长因子（tEGF）作为EGFR的配体。这些结合域与来自PE或DT的催化域和转位域的截短毒素变体融合（SI附录）。将IT构建体转染到经过抗性改造的293FT细胞后，我们通过细胞内流式细胞术测量了IT的表达情况。我们观察到所有IT构建体都可以在抵抗ADPRT的293FT细胞中表达（图2A）。当IT构建体转染到非抗性的293FT细胞中时，存活的IT表达细胞减少，表明所有融合毒素都具有催化活性。然后我们将转染的293FT细胞与含有NCI-H358癌靶细胞的转well板的屏障插入物共培养，或者直接与NCI-H358细胞共培养（图2 B–D和 Movies S1及S2）。为了评估该系统中的其他ITs，我们还测试了结合了替代EGFR靶点scFvs和来自ChxA的ADPRTs的构建体（图2E）（SI附录）。在所有测试的设计中，表达tEGF-PE38的构建体表现出最强的细胞毒性（图2F）。

图2.

九部分图显示了细胞培养实验。图表显示了各种转染构建体和处理条件下的细胞汇合度和面积随时间的变化。

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