《Chemico-Biological Interactions》：Sevoflurane activates ATF4/NSUN7/PRKCD axis to induce neurotoxicity and cognitive impairment by promoting neuron mitochondrial fission
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SEV通过激活ATF4/NSUN7/PRKCD信号轴导致线粒体动力学失衡，引发神经毒性及认知功能障碍，敲除NSUN7可缓解损伤，并揭示m5C修饰调控PRKCD稳定及ATF4转录调控NSUN7的作用机制。
强富|凌晨|熊增|翠琳兰|关华王|舒佳丽|婷敏吕|韩文晨
中国湖南省湘潭市湘潭市中心医院疼痛医学与无痛诊所，邮编411100
摘要：
七氟醚（SEV）已被证实能诱导线粒体功能障碍，从而加速神经毒性。NOL1/NOP2/Sun结构域家族成员7（NSUN7）参与调控神经功能障碍的进展。本研究旨在探讨SEV是否通过调节NSUN7相关通路来介导线粒体动态变化，进而发挥神经毒性作用。正常小鼠和NSUN7基因敲除（KO）小鼠被暴露于SEV（由Baxter Healthcare Corporation提供）。通过Morris水迷宫测试评估小鼠的认知功能，使用HE和Nissl染色、炎症因子及ROS水平来评估神经元损伤。Western blot、qRT-PCR或免疫荧光染色检测NSUN7、线粒体融合/分裂相关标志物、蛋白激酶C delta（PRKCD）和激活转录因子4（ATF4）的表达。从小鼠海马组织中分离出的神经元用SEV处理，通过CCK8检测和流式细胞术测定细胞活力和凋亡情况。利用dot blot、RIP、双荧光素酶报告基因或ChIP检测NSUN7对PRKCD的调控作用，以及ATF4对NSUN7的调控作用。SEV刺激可增强小鼠海马神经元的线粒体分裂和NSUN7表达。NSUN7敲低可抑制线粒体分裂，从而减轻SEV引起的神经元损伤，NSUN7-KO小鼠则改善了SEV引起的神经认知功能障碍。此外，NSUN7通过5-甲基胞嘧啶修饰促进PRKCD的稳定性和翻译，而PRKCD过表达可逆转NSUN7敲低对SEV引起的神经元损伤的抑制作用。同时，SEV通过激活ATF4/NSUN7/PRKCD轴加重神经毒性和认知障碍。总体而言，SEV引起的神经毒性与线粒体分裂及ATF4/NSUN7/PRKCD通路的激活有关，为缓解SEV引起的神经毒性提供了新的思路。
引言
近年来，麻醉恢复后麻醉剂的安全性受到质疑，包括引起的神经元损伤和术后认知功能障碍[1, 2]。七氟醚（SEV）作为一种吸入麻醉剂，因其安全性和有效性被广泛用于手术，但其不良影响也不容忽视[3]。据报道，婴儿长期反复接触SEV会导致发育性神经毒性[4]。类似地，反复接触SEV也会在啮齿动物中引发认知障碍和社会行为紊乱[5]。此外，SEV在临床前和临床环境中也会导致发育中的大脑出现认知障碍[6]。然而，SEV引起神经毒性的具体机制仍有待进一步研究。
线粒体产生的能量维持着中枢神经系统的稳态[7]。线粒体相关的内质网膜（MAM）对线粒体功能和细胞存活至关重要[8]。研究表明，反复接触SEV会导致神经元凋亡和线粒体功能障碍，并抑制MAM的结构[9]。有研究报道SESN1可减轻SEV引起的神经炎症和线粒体功能障碍[10]。Chen等人发现，SEV在老年大鼠中引起的认知功能障碍与线粒体自噬损伤有关[11]。因此，揭示SEV引起神经毒性中影响线粒体动态的分子机制可能为治疗提供潜在靶点。
5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种RNA修饰方式，可调节哺乳动物细胞中的基因表达[12]，在包括RNA稳定性、核输出和蛋白质翻译在内的生物过程中起关键作用[13]。m5C在中枢神经系统疾病发病机制中的重要性已有报道[14]。特别是，m5C影响的多种分子机制可能导致神经认知障碍背后的神经元和突触功能障碍[15]。NOL1/NOP2/Sun结构域家族成员7（NSUN7）是m5C修饰酶的成员之一[16]。Cui等人发现NSUN7在12种癌症中表达上调，且可能影响患者的生存率和预后[17]。重要的是，NSUN7在神经功能障碍患者海马区的表达也有所增加[15]。然而，NSUN7是否参与SEV引起的神经毒性和认知功能障碍尚不清楚。
蛋白激酶C delta（PRKCD）属于PKC家族，具有多种生物学特性[18]。研究发现PRKCD会促进SEV引起的神经毒性和认知功能障碍[19]。另一项研究显示PRKCD位于线粒体内，可调节ULK1-ATG13的招募，从而诱导线粒体自噬[20]。我们通过RMVar数据库预测发现PRKCD 3’-UTR区域存在m5C修饰位点。然而，NSUN7修饰的PRKCD是否通过调节线粒体动态来影响SEV引起的神经毒性尚不清楚。
激活转录因子4（ATF4）属于ATF/CREB家族，其主要功能是通过作为转录因子来调节基因表达[21]。先前的研究表明，ATF4通过NRF1-TFAM通路在酒精性脂肪性肝炎中促进肝线粒体功能障碍[22]。重要的是，SEV通过调节ATF4相关通路促进海马内质网应激（ERS）和神经元凋亡，从而引发术后认知功能障碍[23]。JASPAR软件预测NSUN7启动子区域存在2个ATF4结合位点。尽管如此，ATF4是否通过调节NSUN7表达来影响SEV引起的线粒体功能障碍和神经毒性仍需进一步验证。
本研究系统阐明了SEV麻醉引起神经认知功能障碍的新分子机制，即ATF4/NSUN7/PRKCD信号轴通过调节线粒体功能和动态来介导海马神经元损伤。这一发现从m5C甲基化的新角度揭示了麻醉剂神经毒性的调控网络，突显了NSUN7作为关键调控节点的核心作用。这不仅为理解围手术期神经认知障碍的发病机制提供了新的理论基础，还为临床干预提供了多个潜在的治疗靶点（如NSUN7或PRKCD）。
实验部分
小鼠实验
新生C57BL/6雌性和雄性小鼠（出生后6天）被随机分为对照组、SEV组、SEV+ATF4慢病毒shRNA组（SEV+sh-ATF4）和SEV+sh-ATF4+pcDNA NSUN7过表达载体组（SEV+sh-ATF4+pc-NSUN7）（每组8只）。SEV由Baxter Healthcare Corporation（美国伊利诺伊州迪尔菲尔德）提供。其中，SEV组小鼠每天连续暴露于3%的SEV环境中2小时，持续3天[19]。在SEV处理前一周，SEV+sh-ATF4组小鼠...
SEV促进小鼠海马神经元的线粒体分裂和NSUN7表达
首先，研究了SEV对小鼠神经毒性和认知功能障碍的影响。MWM实验结果显示，与对照组相比，SEV组的逃避潜伏时间和平均路径长度增加，而目标象限的停留时间和平台穿越次数减少（图1A-D）。HE和Nissl染色结果显示海马神经元的形态受损，健康海马神经元的数量显著减少...
讨论
术后认知功能障碍常导致患者生活质量和独立性下降，给家庭带来精神和经济负担[26]。SEV作为一种吸入麻醉剂在临床实践中被广泛使用[27]。然而，最新研究表明SEV可导致线粒体功能障碍，进而引发神经毒性和认知功能障碍[28]。SEV通过增加...
结论
总之，我们的研究揭示了SEV引起神经毒性的潜在分子机制。研究表明，SEV通过激活ATF4/NSUN7/PRKCD轴促进线粒体分裂，从而导致小鼠的神经毒性和认知障碍。这些结果提示，靶向抑制ATF4/NSUN7/PRKCD轴可能有助于缓解SEV引起的神经毒性。
作者贡献声明
婷敏吕：研究工作、数据分析。韩文晨：研究工作、数据分析。舒佳丽：研究工作、数据分析。翠琳兰：研究工作、数据分析。关华王：研究工作、数据分析。强富：研究工作、数据分析。凌晨：研究工作、数据分析。熊增：项目管理、方法学设计
伦理声明
本实验获得了南方医科大学第八附属医院（顺德市第一人民医院）伦理委员会的批准。
数据共享
本研究使用或分析的数据集可应合理要求向相应作者索取。
资助
本工作得到了广东省医学科技研究基金项目（A2025023）；南方医科大学第八附属医院科学研究启动项目（种子项目，SRSP2024028）；南方医科大学第八附属医院科研启动项目（博士研究启动项目，SRSP2023011）；南方医科大学第八附属医院科研启动项目（种子项目）的支持。利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知利益冲突或个人关系。
