《PLOS Pathogens》：DMEM and EMEM as alternate growth media for pathogenic Leptospira
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为解决钩端螺旋体病研究中动物模型依赖性强、传统培养基（EMJH）无法模拟宿主环境等问题，研究人员评估了DMEM、EMEM、HAN等多种培养基在37°C、5% CO2条件下培养致病性钩端螺旋体（L. interrogans）的效果。通过转录组学和脂质A谱分析，他们发现DMEM和EMEM能诱导钩端螺旋体产生与体内感染（仓鼠全血）相似的基因表达谱和脂质A谱，优于传统EMJH和HAN培养基。该研究为钩端螺旋体致病机制研究提供了一个成本低廉、可重复性高且能有效减少动物使用的体外研究替代方案。
钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体（Leptospira）引起的人畜共患疾病，在全球范围内，尤其是热带地区的贫困人群中造成了沉重的疾病负担。这种细菌的生活周期颇为独特，它能在自然环境（如水、土壤）中长期存活，也能感染多种哺乳动物宿主并在其肾脏中定植，进而通过尿液排出，污染环境，形成传播循环。然而，我们对这种细菌如何在如此多样的环境中生存，特别是在感染宿主时如何引发疾病的分子机制，却知之甚少。这其中一个关键障碍在于实验室的研究工具：数十年来，科学家们主要使用一种名为EMJH的培养基在29-30°C的常温、有氧条件下培养钩端螺旋体。这种条件与哺乳动物体内37°C、5% CO2的温暖、微环境相去甚远，导致在“舒适”实验室环境中长大的细菌，其基因表达、蛋白质组成乃至表面结构都可能与真实感染宿主时的状态大不相同。这种“失真”严重限制了体外实验结果的可靠性，使得许多基础研究不得不高度依赖仓鼠等动物模型，这不仅涉及伦理问题，也增加了研究成本、时间并影响了结果的可重复性。那么，能否找到一种既经济实惠、又能在实验室里更好地模拟宿主体内环境的培养方法呢？这正是本项研究试图回答的核心问题。
为了系统评估不同培养条件对致病性钩端螺旋体的影响，研究人员设计并开展了一系列严谨的实验。首先，他们在多种培养基（包括传统的EMJH、商业细胞培养基EMEM和DMEM、以及新近开发的HAN培养基）和不同温度/CO2条件下培养了问号钩端螺旋体（L. interrogans）哥本哈根血清型Fiocruz L1-130菌株，绘制了生长曲线并评估了细菌在仓鼠模型中的毒力。接着，为了获得体内感染的“黄金标准”参照，他们从感染7天后的仓鼠全血（Whole Blood, WB）中直接分离出钩端螺旋体。研究的核心是比较分析：他们利用RNA测序（RNA-seq）技术，全面比较了在不同培养基中生长的钩端螺旋体与来自感染仓鼠全血（WB）的钩端螺旋体在全基因组范围内的转录组差异。此外，他们还运用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI Mass Spectrometry）及质谱成像（Mass Spectrometry Imaging）等先进技术，分析了不同培养条件下钩端螺旋体关键毒力因子——脂质A（Lipid A，脂多糖LPS的组成部分）的结构谱。这些技术的结合，使得研究人员能够从基因表达和膜结构分子两个层面，全方位评估不同体外培养条件模拟体内环境的真实程度。
研究结果
1. 培养基成分和培养条件决定致病性钩端螺旋体的生长行为但不影响其毒力
研究人员观察到，钩端螺旋体在不同培养基中生长模式迥异。在DMEM和EMEM培养基（37°C, 5% CO2）中，细菌呈快速指数增长，第4天达到峰值；而在EMJH（29°C）和HAN（37°C, 5% CO2）中，则需要更长时间（分别为第10天和第14天）才进入平台期。值得注意的是，在EMJH培养基中于37°C下培养钩端螺旋体无法支持其有效生长。然而，无论使用哪种培养基进行体外培养，得到的钩端螺旋体在仓鼠模型中均能引发致命的感染，表明这些培养条件并未削弱该菌株的毒力。
2. 全血作为钩端螺旋体感染中宿主环境的替代物
定量PCR分析显示，感染仓鼠全血中的钩端螺旋体载量显著高于其血清和血浆。因此，研究选择感染后7天的仓鼠全血作为代表体内宿主环境的对照样本，用于评估各体外培养基的模拟效果。
3. 致病性钩端螺旋体的转录组谱受不同培养条件调控，在37°C和5% CO2下的生长可激发与宿主环境密切相关的基因转录
转录组分析揭示，与传统EMJH条件相比，在其他培养基（DMEM、EMEM、HAN）和仓鼠全血（WB）中，钩端螺旋体有大量基因表达发生显著变化。主成分分析显示，DMEM和EMEM培养的样本在基因表达谱上与WB样本更为接近，而HAN样本则与EMJH更相似。进一步分析发现，一些已知的重要毒力相关基因（如ligA, ligB, sph2）在WB、DMEM、EMEM和HAN中均呈现上调趋势，而在EMJH中则不然。
4. DMEM和EMEM培养基是模拟宿主环境的体外替代方案
相关性分析和差异表达基因（DEGs）共享度统计提供了更确凿的证据。DMEM和EMEM培养的钩端螺旋体，其基因表达与WB样本的相关系数最高（0.84-0.87）。更重要的是，在WB中鉴定出的所有差异表达基因中，有40%和47%分别与在DMEM和EMEM中鉴定的差异表达基因重叠。相比之下，HAN培养基仅有20%的重叠度。这表明，DMEM和EMEM在诱导钩端螺旋体产生类似于体内感染的基因转录模式方面，远优于HAN和传统EMJH。
5. 在37°C、5% CO2条件下进行体外培养可诱导钩端螺旋体脂质A生物合成基因的宿主样表达
脂质A是钩端螺旋体脂多糖（LPS）的毒性核心，其结构变化与细菌的环境适应和免疫逃逸密切相关。基因表达分析显示，与脂质A生物合成相关的多个基因（如lpxC, lpxK）在WB样本及DMEM、EMEM、HAN培养的细菌中表达趋势相似，而与EMJH条件存在差异，提示培养条件能在转录水平影响脂质A的合成。
6. 问号钩端螺旋体在DMEM和EMEM培养基中的脂质A谱与在宿主环境中直接观察到的相似
质谱分析结果直观地印证了上述基因表达的发现。在EMJH和HAN培养基中生长的钩端螺旋体，其脂质A谱非常复杂，含有多种不同酰化程度的离子簇。而在DMEM和EMEM中生长的细菌，其脂质A谱则显著简化，主要包含一个基峰在m/z1748的六酰化脂质A簇。最具说服力的是，利用质谱成像技术直接在感染仓鼠的肝脏组织中检测到的钩端螺旋体脂质A谱，与在DMEM和EMEM培养基中观察到的谱图高度相似，其主峰同样位于m/z1748附近。这首次直接在宿主组织中表征了钩端螺旋体的脂质A，并证实DMEM和EMEM培养基能诱导产生更接近体内状态的脂质A结构。
研究结论与重要意义
本研究通过综合转录组学和脂质组学分析，系统论证了使用商业细胞培养基DMEM和EMEM在37°C、5% CO2条件下培养致病性钩端螺旋体的可行性与优越性。主要结论是：与当前常用的EMJH培养基或新开发的HAN培养基相比，DMEM和EMEM能更真实地模拟钩端螺旋体在哺乳动物宿主内的生存环境。这体现在两个方面：第一，它们能诱导钩端螺旋体产生与体内感染状态更为相似的全局基因表达谱，共享更高比例的差异表达基因；第二，它们能促使钩端螺旋体形成与其在感染组织中结构更为接近的脂质A分子谱。这些由Katherine E. B. Knapp、Mariana G. de Oliveira、Hannah M. Knapp、Sandra L. Silva等人完成的研究，其意义重大而深远。
首先，该研究为钩端螺旋体致病机制的基础研究提供了一个强大、可靠且易于获取的体外研究工具。DMEM和EMEM作为全球标准化供应的商品化培养基，成分明确、成本低廉，解决了传统EMJH培养基制备复杂、批次间可能存在差异的问题，极大地提高了实验的可重复性。其次，这项研究有力地呼应了动物实验的“3R”原则（减少、替代、优化）。通过使用这种能更好模拟体内环境的体外系统，研究人员可以在许多探索性研究中减少对活体动物的依赖，既能降低研究成本、缩短周期，也符合动物福利的伦理要求。最后，该发现对钩端螺旋体病的疫苗和诊断技术研发具有潜在启示。由于脂质A是激活宿主天然免疫的关键分子，其在体内外的结构差异可能影响免疫应答的强度和性质。使用DMEM/EMEM培养的、具有“宿主样”脂质A的钩端螺旋体进行免疫学研究或疫苗候选株评估，或许能产生更贴近真实感染保护效力的结果。总之，这项发表在《PLOS Pathogens》上的工作，不仅为钩端螺旋体研究领域推开了一扇新的大门，也为其他难以在体外模拟宿主环境的病原体研究提供了有价值的思路。
