基于2-芳氨基和7-H-吡咯[2,3-d]嘧啶骨架的共价JAK3抑制剂：设计、合成及其在博来佐米耐药多发性骨髓瘤治疗中的潜在生物活性评估

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Covalent JAK3 inhibitors based on 2-arylamino and 7 H-pyrrolo[2,3- d]pyrimidine scaffold: design, synthesis, and biological evaluation for the potential treatment of Bortezomib-resistant multiple myeloma

JAK3抑制剂7n通过阻断JAK-STAT通路抑制耐药性多发性骨髓瘤细胞增殖并抑制肿瘤生长，具有高选择性和生物利用度。

　　

田亮亮|李佳迅|于家文|韩庆轩|纳菲瑟·博尔加纳巴迪|王凯|陈志平|徐铮|楚鹏|陈丽雪

大连医科大学药学院、医学实验室学院、基础医学科学学院，中国大连116044

摘要

硼替佐米作为第一代蛋白酶体抑制剂，是治疗多发性骨髓瘤的关键药物之一。然而，其长期临床疗效受到原发性和获得性耐药性的严重限制。研究表明，在某些对硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞中，Janus激酶3/信号转导子和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路可能持续激活。本文设计、合成并评估了一系列含有丙烯酰胺基团的2-芳基氨基嘧啶衍生物作为强效的JAK3抑制剂。其中，化合物7n表现出较强的JAK3结合能力（半数抑制浓度[IC₅₀] = 0.7473 nM），并对硼替佐米耐药的KM3细胞具有有效的抗增殖活性（IC₅₀ = 0.2452 μM）。药代动力学分析结果显示7n具有良好的口服生物利用度，F值为39.11%。此外，在小鼠硼替佐米耐药KM3细胞异种移植模型中，7n显著抑制了肿瘤生长。作用机制分析证实7n能够抑制细胞迁移，促进细胞凋亡，并阻断JAK–信号转导子和转录激活因子通路。值得注意的是，在5 nM浓度下，7n对JAK3的抑制率高达96.87%。总体而言，这些发现表明JAK3是开发治疗硼替佐米耐药多发性骨髓瘤抑制剂的潜在靶点，而7n是一个有前景的候选化合物。

引言

Janus激酶（JAK）家族是非受体酪氨酸激酶，在细胞内信号转导中起着关键作用[1]。它们可被多种配体（如干扰素、脂多糖或生长因子）激活，从而磷酸化相关的JAKs。随后，JAKs招募信号转导子和转录激活因子（STAT）蛋白（如STAT1、2、3、4、5A、5B和6），这些蛋白转运至细胞核并激活目标基因[2–4]。JAK–STAT通路的过度激活已在许多自身免疫性疾病和血液系统肿瘤中得到报道，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化症和急性髓系白血病[2]、[5]。

JAK家族包括四个成员：JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2[6]。与其他广泛表达并与多种细胞因子受体结合的JAKs不同，JAK3主要在造血组织细胞中表达，如骨髓细胞、胸腺细胞、自然杀伤细胞以及活化的B细胞和T细胞[7]、[8]、[9]。研究表明，在某些多发性骨髓瘤病例中JAK3持续激活，这表明其可作为治疗靶点。因此，靶向JAK3抑制可能是治疗血液系统恶性肿瘤和自身免疫性疾病的有效策略。

一些已在实验室或临床试验中评估的JAK抑制剂包括托法替尼[1]、帕克替尼[2]、利特西替尼（PF-06651600[3]）、[4]、AZD1480[5]和塞尔杜替尼[6]等。其中，托法替尼作为一种典型的JAK3抑制剂，于2012年获美国食品药品监督管理局批准用于治疗自身免疫性疾病。佩菲替尼于2019年获药品和医疗器械管理局批准用于治疗类风湿性关节炎。化合物3和4是两种在临床研究中研究的选择性JAK3抑制剂，它们能与JAK3中的Cys⁹⁰⁹残基形成强共价键以发挥抑制作用。AZD1480基于其对JAK2–STAT3通路的抑制作用被研究用于治疗多发性骨髓瘤。塞尔杜替尼是一种新型的双重脾酪氨酸激酶/JAK抑制剂，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中表现出广泛的抗肿瘤活性。然而，这些抑制剂在肿瘤学中的应用仍局限于临床研究阶段。JAK3抑制剂在肿瘤学中的研究主要集中在血液系统恶性肿瘤，特别是T细胞淋巴瘤和白血病。临床研究包括一项II期试验（NCT05879458），探讨利特西替尼治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），以及一项II期试验（NCT06698822），评估托法替尼治疗早期（IA、IB、IIA）皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的效果。近年来，还有几种新型的共价JAK3抑制剂被报道。例如，崔等人[18]在PF-06651600的先导化合物中引入了氟取代苯环，用于治疗自身免疫性脑脊髓炎，优化后的化合物在体内和体外均表现出良好的活性和选择性。同时，陈等人[19]设计了三个独立的共价DNA编码文库（DELs），通过这些文库筛选JAK3纯化蛋白，发现了一系列高效且选择性的JAK3共价抑制剂。

多发性骨髓瘤是第二常见的B细胞系淋巴系统恶性肿瘤。最近的治疗进展，包括蛋白酶体抑制剂以及将免疫调节药物（如硼替佐米、来那度胺和程序性细胞死亡（PD）-1/PD配体1抑制剂）纳入一线和挽救治疗方案，显著提高了多发性骨髓瘤患者的生存率[20]、[21]。然而，由于固有和/或获得性的癌症药物耐药性以及促进耐药性骨髓瘤克隆逃逸的免疫抑制性肿瘤微环境，治疗失败和复发仍然很常见[22]、[23]。因此，进一步优化和开发新型JAK3抑制剂对于推进多发性骨髓瘤研究尤为重要。

2,4-二芳基氨基嘧啶骨架能够有效抑制多种激酶的活性，包括JAK[24]、 focal adhesion kinase（FAK）[25]、Bruton’s tyrosine kinase（BTK）[26]和表皮生长因子受体（EGFR）[27]、[28]。对接结果显示，塞尔杜替尼中的2-芳基氨基嘧啶与JAK3中的Lue⁹⁰²残基形成了两个强氢键，使分子定位在催化域上。对于PF-06651600（PDB: 5TOZ），结构中的丙烯酰胺药效团与Cys⁹⁰⁹残基的巯基发生迈克尔加成反应，形成共价键，将抑制剂连接到目标酶的催化区域。基于塞尔杜替尼和PF-06651600的结构特征，我们在2-芳基氨基嘧啶的C-4位置引入了含有丙烯酰胺药效团的取代基，作为设计共价JAK3抑制剂的有效策略（图2）。此外，还进行了结构优化，设计并合成了一系列含有丙烯酰胺药效团的2-芳基氨基嘧啶衍生物，并在体外和体内进行了评估。

化学部分

所设计的2-芳基氨基嘧啶衍生物7a–q的合成路线如图1所示。简而言之，8a/b在碱条件下与9a/b反应生成10a–c。通过乙酸乙酯/HCl去除Boc基团，并通过调节pH至8～9释放HCl。随后引入药效团丙烯酰胺以合成关键中间体11a–c12的醚键被水解，暴露出羟基

结论

本研究中，合成的7n不仅对JAK3表现出强抑制活性，还对属于多发性骨髓瘤细胞系的硼替佐米耐药KM3细胞具有更强的抗增殖活性。此外，7n具有良好的口服生物利用度，并在鼠类硼替佐米耐药KM3细胞异种移植模型中显著抑制了肿瘤生长。同时，研究发现7n诱导的硼替佐米耐药KM3细胞凋亡的机制是

通用方法和化学方法

除非另有说明，否则使用未经进一步纯化的商业溶剂和试剂。高分辨率质谱（HR MS，ESI）在Agilent 1100 HPLC/MS系统上进行。¹³C NMR和¹H NMR谱在DMSO-d或CDCl₃中记录。NMR的耦合常数（J）以赫兹（Hz）表示。化学位移（d）以百万分之一（ppm）为单位，相对于内标（TMS）报告。TLC用于通过硅胶监测反应

CRediT作者贡献声明

韩庆轩：数据整理。李佳迅：方法学研究、数据整理。于家文：数据整理。楚鹏：资源获取、实验研究、数据整理。陈丽雪：写作——审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金获取、概念构思。田亮亮：初稿撰写、验证、方法学研究、数据整理。纳菲瑟·博尔加纳巴迪：数据整理。王凯：数据整理。陈志平：数据整理。徐铮：验证、项目管理

未引用参考文献

[3]、[4]。

资助

本研究得到了大连市科技之星计划（2021RQ012）和辽宁省教育厅科学研究基金（LJ212410161013）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

激酶分析工作是与ICE Bioscience合作完成的。