Arenobufagin 通过 HCAR1-GPX4/SLC7A11 抗氧化轴诱导胃癌干细胞的铁死亡

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Arenobufagin Induces Ferroptosis in Gastric Cancer Stem Cells via the HCAR1-GPX4/SLC7A11 Antioxidant Axis

胃癌癌干细胞增殖及自我更新被Arenobufagin通过HCAR1通路诱导铁死亡所抑制，其机制涉及GPX4/SLC7A11轴调控及氧化应激失衡，为胃癌治疗提供新策略。

　　

王海南|王宁|顾伟|王曼曼|程辉|何世明|王蒙|李青琳

安徽中医药大学中西医结合学院，中国合肥230012

摘要

从蟾蜍毒液中提取的甾体化合物阿瑞诺巴辛（ARBU）具有多种靶点的药理活性，但其调节胃癌干细胞（GCSCs）中铁死亡（ferroptosis）的作用尚不清楚。本研究通过体外球状细胞培养、类器官模型和异种移植实验系统评估了ARBU的抗肿瘤作用及其机制。ARBU以浓度依赖性方式抑制GCSC的增殖和球状细胞形成，降低类器官中的EdU掺入量和SOX2表达，并在体内显著抑制肿瘤生长，同时下调SOX2和Nanog基因，且具有良好的生物安全性。机制研究表明，ARBU通过诱导铁死亡发挥作用，表现为MDA、ROS和Fe²⁺水平升高，GSH和SOD下降，线粒体损伤，COX2上调以及GPX4/SLC7A11下调。RNA-seq和功能研究进一步发现，HCAR1在GCSC的自我更新和抗氧化防御中起关键作用，ARBU通过抑制HCAR1促进铁死亡。总体而言，这些结果表明ARBU通过下调HCAR1通路诱导铁死亡来抑制GCSC的增殖和干性，显示出其作为胃癌治疗候选物的潜力。

引言

胃癌（GC）仍然是一个严峻的全球健康挑战，其发病率持续上升（Yasuda T, 2024）。晚期GC的不良预后主要由转移和化疗耐药性驱动，而这些过程主要由胃癌干细胞（GCSCs）维持（Chen, Q. et al., 2023; Kim et al., 2024）。GCSCs被认为是肿瘤发生和自我更新的根源，它们利用包括Wnt/β-连环蛋白（Ji et al., 2018）、Notch和Hedgehog在内的保守通路，以及促肿瘤微环境来逃避免疫和抵抗治疗（Razi et al., 2023; Wu et al., 2023）。因此，识别GCSC群体中的特定代谢脆弱性对于改善临床结果至关重要。

一个特别有前景的脆弱性是铁死亡，这是一种依赖铁的调节性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化和线粒体浓缩（Lei et al., 2024）。与凋亡或自噬不同，铁死亡主要由System X_c^-/GPX4轴调控（Li, J. et al., 2023; Wang et al., 2020）。值得注意的是，GCSCs的细胞内铁含量高于非干细胞，使其特别容易受到铁死亡诱导剂的影响（Zhang et al., 2021）。这种敏感性已在多种恶性肿瘤中得到验证；例如，针对结直肠癌中的ROS可以抑制干细胞球状细胞的形成（Wang et al., 2019），而维生素D等化合物通过下调SLC7A11在胶质瘤GCSCs中诱导铁死亡（Ingold et al., 2018; Lee and Roh, 2022; Li, D. et al., 2023）。然而，启动和控制GCSCs中这种铁死亡级联反应的上游代谢传感器仍不明确。

在潜在的代谢传感器中，HCAR1（GPR81）是一个关键候选者，它是一种由乳酸和β-羟基丁酸等代谢物激活的G蛋白偶联受体（Fan and Yao, 2023）。除了其在能量代谢和应激反应中的已知作用（He et al., 2025; Jin et al., 2022）外，HCAR1在调节GCSCs铁死亡中的脂质过氧化特征中的具体作用尚未阐明。这一知识空白促使人们需要药理学工具来研究HCAR1是否可作为调节GCSC死亡的可调开关。

在这种情况下，我们关注了从传统中药蟾酥中提取的天然蟾蜍皂苷类化合物阿瑞诺巴辛（ARBU）。ARBU通过调节氧化应激在多种恶性肿瘤中表现出强烈的抗肿瘤活性（Wang et al., 2024; Yang et al., 2024; Zhao, J. et al., 2020）。虽然已知ARBU通过Rev-erbα在普通GC细胞中诱导铁死亡（Chen, K. et al., 2023），但其对GCSCs的具体影响以及HCAR1依赖性通路的可能参与尚待明确。本研究旨在评估ARBU的治疗潜力，并阐明HCAR1在GCSCs中驱动铁死亡的分子机制。

材料与试剂

阿瑞诺巴辛（纯度：94.1%，分子式C₂₄H₃₂O₆，分子量：416.51，CAS：464-74-4）购自安徽华润金川药业有限公司（中国淮北）。5-氟尿嘧啶（5-FU）购自MCE（中国）。DMEM/F-12培养基（C3130-0500）购自VivaCell（中国），B-27补充剂（17504044）购自Gibco（美国）。Ferrostatin-1（Fer-1；S7243）和Erasstin（S7242）购自Selleck（美国）。HCAR1过表达质粒（pcDNA3.1-HCAR1）和...

ARBU抑制MKN45-CSCs的增殖和干性标志物表达

为了评估阿瑞诺巴辛的治疗潜力，我们首先使用球状细胞培养系统富集GCSCs（图1A）。在这种条件下，分散的MKN-45细胞在七天内成功转化为直径约75 μm的致密肿瘤球体（图1B）。通过多种标志物验证了这些富集的GCSCs的身份：流式细胞术显示CD44⁺细胞群显著扩增（图1C），

讨论

胃癌仍然是一个严重的全球健康挑战，其发病率和死亡率持续很高（Guan et al., 2023）。这种恶性肿瘤的临床进展通常由转移和复发以及化疗耐药性驱动，而这些都与胃癌干细胞的生物学活性密切相关。CSC理论认为GCSCs是肿瘤进展的关键因素，因此针对GCSCs可能是一种有效的治疗策略

结论

总之，我们的研究表明，ARBU显著抑制GCSCs的增殖和干性，并通过诱导铁死亡发挥抗肿瘤作用。其潜在机制可能涉及下调HCAR1表达，调节铁代谢和氧化还原稳态，通过调控GPX4和SLC7A11等关键脂质过氧化调节因子，从而破坏支持GCSC存活的微环境。此外，ARBU与...

CRediT作者贡献声明

王宁：研究、数据分析。顾伟：数据可视化、资源管理、方法学、数据分析。王曼曼：软件使用、方法学、研究。程辉：软件使用、资源管理。何世明：数据可视化、验证、资源管理、资金获取。王蒙：撰写-审稿与编辑、项目管理、方法学、资金获取。李青琳：撰写-审稿与编辑、验证、监督、研究、资金获取。王海南：撰写-

未引用参考文献

Chen et al., 2023; Li et al., 2023; Xiong et al., 2022.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金[项目编号：82305023（资助给王蒙）]、安徽省博士后研究项目[项目编号：2024C835（资助给王蒙）]、安徽中医药大学2022年首批人才支持计划项目[项目编号：2022rcyb016（资助给王蒙]以及蚌埠医科大学癌症转化医学重点实验室[项目编号：KFKT202402（资助给王蒙）]和蚌埠医学院龙湖人才计划的支持。