《Experimental and Molecular Pathology》：Development and validation of a tumor-derived CXCL1 qPCR assay to support patient selection for anti-CXCL1 therapeutics in bladder cancer
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为解决免疫组化（IHC）检测CXCL1的局限，研究人员开发并验证了一种用于FFPE肿瘤样本的qPCR检测技术。该检测在肌层浸润性膀胱癌（MIBC）中显示出优异的分析性能及与RNA-seq的高一致性，为CXCR2-CXCL1轴靶向治疗的伴随诊断提供了强大工具。
在癌症治疗迈向精准医疗的时代，准确识别能从特定靶向疗法中获益的患者是关键。以膀胱癌为例，其侵袭性亚型——肌层浸润性膀胱癌（MIBC）——即使接受了新辅助化疗和根治性膀胱切除术，仍有约一半患者会发生转移。研究表明，CXCR2-CXCL1信号轴是驱动肿瘤发生的关键，其中CXCL1（一种分泌性趋化因子）的高表达与膀胱癌不良预后相关。然而，现有的主流检测方法——免疫组化（IHC）——在评估CXCL1时却遇到了困境。因为CXCL1是分泌蛋白，染色信号可能源自肿瘤细胞本身，也可能来自周围的基质细胞或免疫细胞，甚至可能是滞留在细胞外空间的蛋白，这给精确量化肿瘤内源性的CXCL1水平带来了挑战。为了精准筛选出适合接受CXCR2-CXCL1轴靶向治疗的患者，临床亟需一种能够客观、定量检测CXCL1表达水平的可靠方法。这正是发表于《Experimental and Molecular Pathology》杂志上的这项研究所要解决的核心问题。
为应对这一挑战，研究人员开发并系统地验证了一种基于定量PCR（qPCR）的检测方法，专门用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的肿瘤标本中定量CXCL1的mRNA表达。这项研究并非临床验证，而是着重于对检测平台的分析学验证。研究团队从美国Cedars-Sinai医学中心获取了MIBC患者的FFPE组织样本，并与部分样本的匹配新鲜冰冻（FF）组织进行比对。他们还利用了一个来自加拿大不列颠哥伦比亚大学、包含47名接受新辅助化疗后行根治性膀胱切除术的MIBC患者的独立队列，用于将该qPCR检测结果与RNA测序（RNA-seq）数据进行交叉平台验证。研究涵盖了从样本前处理、分析到可重复性的全方位验证。
研究结果：
1. 前处理分析验证
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FFPE与FF样本可比性：在配对的新鲜冰冻（FF）组织和FFPE组织中，CXCL1的表达水平高度相关（Pearson, r = 0.95），平均表达量无显著差异（配对t检验P = 0.78）。这表明该检测方法与临床上常规存档的FFPE样本兼容性良好。
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不同储存条件下的RNA稳定性：将FFPE组织切片块在室温、4°C、-20°C和-80°C下储存1、7或14天后再提取RNA。结果显示，在≤4°C下储存两周，CXCL1表达基本保持稳定；而室温下储存7或14天的样本，其表达量出现可见的下降，表明RNA可能发生了部分降解。
2. 分析验证
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组织质量（坏死耐受性）：尽管随着坏死比例增加，RNA产量下降，但在坏死比例高达80%的样本中，目标基因的qPCR表达仍可被检测到。当坏死比例超过约80%时，qPCR重复孔间的结果变得不稳定。这表明该检测对中度坏死组织具有耐受性。
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RNA输入量耐受性：在5到100 ng的宽范围RNA输入量下，CXCL1的平均表达水平保持稳定，无显著差异（重复测量方差分析, P = 0.30）。虽然在最低输入量（5 ng）时，qPCR扩增有时不稳定，但在RNA输入量≥20 ng时，检测表现可靠。
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可重复性：由两名技术人员独立处理相同样本，结果显示CXCL1表达水平高度一致，无显著差异（配对t检验P = 0.84），且操作者间相关性高（Pearson r = 0.80）。这表明该检测具有很好的操作者间可重复性。
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qPCR表达与RNA-seq的交叉平台验证：在47名MIBC患者的队列中，qPCR测得的CXCL1表达值与RNA-seq获得的转录本丰度（TPM）呈现强正相关（Pearson r = 0.88）。这证明了该qPCR检测与RNA-seq平台具有高度一致性，结果可靠。
结论与讨论
本研究成功开发并分析验证了一种用于在FFPE膀胱癌标本中定量CXCL1表达的qPCR检测方法。该检测在多方面展现出强大的分析性能：与新鲜冰冻组织结果高度一致；在标准储存条件下稳定；在广泛的RNA输入量范围内表现稳健；对中度坏死的组织有良好耐受性；并且在不同操作者间具有高度的可重复性。最重要的是，在与RNA-seq的交叉平台验证中表现出色，证实了其在临床样本中定量CXCL1表达的可靠性。
这项研究的意义在于，它为解决CXCL1检测的难题提供了一个定量、可扩展的解决方案。相较于IHC，这种基于mRNA的qPCR方法能更客观地反映肿瘤块中CXCL1的整体转录水平，避免了蛋白分泌和基质背景带来的干扰。该检测平台在保持qPCR技术可及性和可扩展性的同时，具备了与RNA-seq相当的准确性，为未来的临床转化奠定了基础。它有望成为一种潜在的伴随诊断工具，用于精准筛选那些CXCL1高表达的膀胱癌患者，从而使其能够进入靶向CXCR2-CXCL1轴的临床试验并从中获益，例如正在进行的多项结合SX-682（一种CXCR2抑制剂）与其他药物的临床试验。这标志着向膀胱癌的精准治疗迈出了关键一步，通过可靠的生物标志物检测，确保合适的患者获得合适的治疗。
