《Food Bioscience》：Effects of malondialdehyde-induced oxidative modifications on the techno-functional and in-vitro digestive properties of α-Lactalbumin
编辑推荐：
α-乳清蛋白在脂质过氧化产物MDA作用下发生结构改变，表面疏水性及颗粒尺寸增大，溶解性下降，胃肠消化实验显示酶解延迟且高聚肽增多，可能与MDA诱导的蛋白质交联及酶切位点屏蔽有关，为婴幼儿配方食品中脂质-蛋白质相互作用研究提供理论依据。
英宝|卡斯帕·赫廷加|刘瑶伟|周鹏
江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市214122
摘要
α-乳白蛋白富含必需氨基酸，广泛用于含有多不饱和脂肪酸的婴儿配方奶粉和特殊医疗食品中。在加工和储存过程中，这些多不饱和脂肪酸可能会与蛋白质及脂质/脂质衍生物发生相互作用。本研究探讨了脂质过氧化的典型产物——丙二醛（MDA）氧化对α-乳白蛋白的结构、功能性和消化率的影响。光谱技术表明，MDA处理改变了α-乳白蛋白的二级和三级结构，并增加了其表面疏水性。MDA修饰后，α-乳白蛋白的重新水合粒径从约2.00纳米增加到约13.00纳米，SDS-PAGE结果证实了蛋白质发生了交联和聚集现象。此外，MDA修饰还降低了α-乳白蛋白的溶解度和界面性质。体外胃肠道消化实验结果显示，MDA修饰延缓了蛋白质水解过程，从而增加了高分子量肽的含量，并减少了游离氨基酸的释放。这可能是由于MDA诱导的蛋白质聚集，保护了消化酶的水解位点，增强了蛋白质对蛋白水解的抵抗力。本研究的结果为阐释复杂食品系统中的脂质-蛋白质相互作用及其后果提供了理论基础，对配方设计及加工和储存过程中营养成分变化的分析具有重要的参考价值。
引言
α-乳白蛋白（α-La）是一种重要的乳蛋白，富含生物活性肽和必需氨基酸，能够为婴儿提供营养，并促进矿物质的吸收和利用（Ge等人，2024；Han等人，2024）。此外，研究还表明α-La对促进大脑和认知发育（Petersen等人，2020）、增强免疫系统和肠道健康（Nielsen等人，2020）以及调节睡眠/觉醒周期（Layman等人，2018）具有重要作用。基于这些优势，α-La被广泛应用于婴儿配方奶粉和其他功能性食品中。
食品是包含多种营养成分的复杂体系，如脂质、蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素。在食品加工（如加热和喷雾干燥）和储存过程中，蛋白质经常暴露于各种氧化剂的作用下，例如活性氧（ROS）、光线、氧气和脂质氧化产物（Giblin等人，2019；Liu等人，2020；Meyer等人，2012）。
尽管蛋白质氧化在整个食品生产链中都可能发生（Hellwig，2019），但由于其影响不如美拉德反应和脂质氧化明显，因此常常被忽视。Liu等人（2022）研究了肌纤维变化和蛋白质氧化对鳙鱼鱼片持水能力（WHC）的影响，发现丙二醛的引入是导致鱼片持水能力下降的原因。Yu等人（2022）研究了煮沸引起的氧化对鲍鱼肌肉蛋白质消化的影响，发现氧化增加了鲍鱼肌肉的疏水性和聚集程度，并抑制了体外模拟消化速率。关于肉制品中蛋白质氧化的研究已经取得了较为精确的认识；而关于乳清蛋白氧化的信息相对较少。α-La是母乳中最丰富的乳清蛋白，有研究表明添加了α-La的婴儿配方奶粉能更好地模拟母乳的成分和消化模式（H. Huang等人，2022）。此外，将多不饱和脂肪酸添加到功能性食品中是一种常见做法。在同时富含多不饱和脂肪酸和乳清蛋白的婴儿配方奶粉等食品中，这些蛋白质容易成为脂质过氧化产物的攻击目标，包括自由基、过氧化物和活性羰基（Giblin等人，2019；Niu等人，2019）。这些活性物质会攻击氨基酸侧链或多肽主链，导致蛋白质聚集和聚合，从而降低食品的营养价值、功能性和感官特性。研究表明，脂质氧化产生的烷氧基和过氧基自由基或醛类可以直接与蛋白质反应形成蛋白质-脂质加合物（Chen等人，2022；Obando等人，2015）。
在这些脂质氧化产物中，丙二醛（MDA）是最常见的醛类物质，约占多不饱和脂肪酸氧化产生的醛类总量的70%（Ellis，2007；Niu等人，2019）。由于其两个醛基，MDA与蛋白质具有高度反应性，能够与赖氨酸胺基、半胱氨酸巯基、精氨酸胍基和组氨酸咪唑基发生共价修饰，形成MDA-赖氨酸加合物（Schiff碱型或共轭亚胺型）。因此，MDA诱导的蛋白质氧化是研究含有乳清蛋白和多不饱和脂肪酸的食品中脂质氧化对蛋白质影响的一个良好模型（Niu等人，2019）。
鉴于α-La和多不饱和脂肪酸在婴儿配方奶粉及特殊医疗食品中的广泛应用，研究脂质氧化对α-La的影响具有重要意义。据我们所知，目前尚无相关研究探讨脂质氧化产物与α-La之间的相互作用对其结构和消化性质的影响。因此，本研究旨在探讨MDA引起的α-La分子结构变化、体外胃肠道消化特性及功能性质的变化。具体而言，首先测定了α-La中的羰基和总巯基含量；进一步通过蛋白质谱分析、内在荧光和表面疏水性研究结构变化；最后评估了氧化引起的功能性质，包括溶解度、乳化能力以及体外胃肠道消化特性。
化学品和材料
牛α-乳白蛋白（纯度95.3%）购自Agropur Ingredients Inc.（美国明尼苏达州）。猪胃蛋白酶（产品编号P6887）、猪胰酶（产品编号P7545）和猪胆汁（产品编号48305）购自Sigma-Aldrich Co., Ltd.（美国密苏里州圣路易斯）。1,1,3,3-四甲氧基丙烷购自Aladdin Reagent Co., Ltd.（中国上海）。ANS-Na（8-氨基-1-萘磺酸钠）、5,5′-二硫代-(2-硝基苯甲酸）（DTNB）和乙酸乙酯也用于实验。
羰基和巯基含量
蛋白质羰基化是一种不可逆的非酶促修饰过程，会导致氨基酸残基的氧化（Kehm等人，2021）。如图1a所示，随着MDA浓度的增加，α-乳白蛋白的羰基含量显著升高（p < 0.05），表明MDA成功改变了α-乳白蛋白的结构。α-乳白蛋白与MDA孵育后，羰基含量呈浓度依赖性增加。未经修饰的α-乳白蛋白（MDA浓度为0 mM）的羰基含量约为1 nmol/mg蛋白质。
结论
本研究使用脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和α-乳白蛋白模拟了食品加工和储存过程中脂质与乳蛋白之间的氧化相互作用。首先，通过圆二色性（CD）分析了MDA修饰后α-乳白蛋白的结构变化，发现MDA改变了α-乳白蛋白的二级和三级结构，进而导致表面疏水性和粒径增加，同时溶解度降低。
CRediT作者贡献声明
周鹏：撰写 – 审稿与编辑、监督、数据分析、概念构思。刘瑶伟：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。卡斯帕·赫廷加：撰写 – 审稿与编辑、数据验证。英宝：撰写初稿、方法设计、实验实施
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32301984）、江苏省自然科学基金（项目编号BK20231044）、国家重点研发计划（项目编号2022YFD2101504）以及中央高校基本科研业务费（项目编号JUSRP202416004）的支持。
