《Food Bioscience》：Lactoferrin-Derived Hydrophobic Peptide YIYT Alleviates Osteoporosis via Synergistic Activation of
Wnt/β-Catenin and
BMP/Smad Pathways
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乳铁蛋白疏水多肽（LF-HD）成骨活性显著高于亲水多肽（LF-HY），关键功能肽YIYT（酪氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸）被成功分离纯化。体外实验显示YIYT促进成骨细胞增殖、分化及基质矿化，协同激活Wnt/β-catenin和BMP/Smad信号通路，上调BMP-2 1倍、RUNX-2 0.5倍。体内实验表明YIYT显著改善骨质疏松模型小鼠骨密度（+40%）、骨体积分数（+15%）、骨小梁参数，抑制破骨细胞分化（减少TRAP阳性细胞），通过双重调节骨形成与骨吸收实现高效骨代谢改善。
常志辉|洪达|马晓宇|傅百峰|程淑珍|杜明
中国大连理工大学食品科学与技术学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，大连，116034
摘要
骨质疏松症是一个严重的公共卫生问题，其特征是骨形成与骨吸收之间的平衡失调。由于现有临床药物存在显著的副作用，开发安全有效的天然生物活性成分变得日益紧迫。本研究首次证实，乳铁蛋白衍生的疏水肽（LF-HD）的成骨活性显著高于亲水肽（LF-HY），并且成功分离并纯化了关键的功能性疏水肽YIYT（酪氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸）。使用MC3T3-E1亚克隆14进行的体外实验表明，YIYT能够促进成骨细胞增殖、细胞周期进展、分化以及基质矿化，并协同激活Wnt/β-连环蛋白和BMP/Smad信号通路，其中BMP-2的表达增加了约1倍，RUNX-2增加了约0.5倍。在去卵巢小鼠中的体内研究表明，YIYT显著改善了骨代谢，使骨密度增加了约40%，骨体积分数（BV/TV）增加了超过15%，小梁数量（Tb.N）增加了近1倍，小梁厚度增加了约0.05毫米，同时减少了小梁分离并改善了小梁微结构。此外，YIYT调节了RANKL/OPG轴，减少了TRAP阳性的破骨细胞数量，从而减轻了过度骨吸收。总体而言，YIYT通过促进骨形成和抑制骨吸收发挥了双重调节作用，显示出显著的疗效，使其成为预防和治疗骨质疏松症的安全且有前景的生物活性肽候选物。
引言
骨质疏松症是一种全身性的代谢性骨疾病，对全球老龄化人口的骨骼健康构成严重威胁（Guo等人，2025年）。其特征是骨量减少和骨微结构受损，这是由于骨形成与骨吸收过程之间的不平衡造成的（Zhao等人，2021年）。大量老年人患有此病，绝经后妇女由于雌激素不足而面临更高的风险，因为雌激素不足会扰乱正常的骨代谢。其根本病理机制是成骨细胞介导的骨形成不足以抵消过度活跃的破骨细胞导致的骨吸收，最终导致骨骼脆弱性增加和骨折风险上升（Wang等人，2023年）。目前的临床干预主要依赖于抗吸收药物和促骨形成药物，如双膦酸盐、地诺单抗、特立帕肽等，但这些治疗的长期使用常常伴随明显的副作用，包括胃肠道刺激、颌骨坏死和高钙血症（Huang等人，2024年）。这些局限性促使人们广泛研究来自天然产物的安全有效生物活性化合物，以开发副作用较少的替代治疗方法。
乳铁蛋白是一种广泛存在于哺乳动物乳汁中的铁结合糖蛋白，已有多种生物学活性被记录在案，包括抗炎、免疫调节和骨调节作用（Fan等人，2017年；Vagge等人，2020年）。近年来，越来越多的证据表明，从乳铁蛋白水解得到的生物活性肽比完整的乳铁蛋白具有更强的成骨活性（Gruden & Ulrih，2021年）。这些肽具有分子量小、生物利用度高和毒性低的独特优势，使其成为开发抗骨质疏松症药物的理想候选物。在乳铁蛋白衍生的肽中，疏水肽因其独特的结构特性而受到广泛关注：其序列中的疏水氨基酸残基可以增强与细胞膜的相互作用，疏水性调节有助于其插入细胞膜双层而不影响结合亲和力，从而促进细胞渗透并调节细胞内信号通路（Khemaissa等人，2025年）。如果膜穿透肽失去疏水性，其破坏膜的能力就会丧失，这种突变会显著降低HAV在FRhK-4细胞中的增殖和感染性（Nair等人，2019年）。内体逃逸是细胞质递送的关键瓶颈。通过优化疏水性，可以获得GALA3肽，该肽可以显著提高蛋白质药物的内体逃逸效率，从而提高抗肿瘤潜力等（Li等人，2020年）。本研究团队比较了麝香鹿乳中的乳铁蛋白及其衍生物的氨基酸序列以及乳铁蛋白的抗菌活性，发现正电荷和疏水性影响抗菌活性（Xiao等人，2022年）。乳铁蛋白中发现的其他具有抗菌活性的肽都是疏水性的，例如Pei等人研究的肽（Pei等人，2020年）。疏水肽在牡蛎蛋白中的乳化活性和乳液稳定性显著增强，这表明它们具有作为乳化剂的巨大潜力（Wang等人，2021年）。我们团队之前未发表的研究从乳铁蛋白的水解产物中分离并鉴定了特定的疏水肽YIYT（酪氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸）。迄今为止，现有研究仅揭示了乳铁蛋白衍生疏水组分的可能功能作用，但YIYT肽片段尚未被分离和鉴定，与其成骨作用相关的分子机制也尚未完全阐明。
Wnt/β-连环蛋白和BMP/Smad信号通路被认为是成骨细胞分化和骨形成的核心调节因子（Wang等人，2022年）。Wnt/β-连环蛋白通路通过抑制糖原合成酶激酶-3β的活性来发挥成骨作用，减少β-连环蛋白的磷酸化降解；积累的β-连环蛋白转运到细胞核并与转录因子结合，激活与成骨相关的基因表达（Qiu等人，2020年）。BMP/Smad通路由骨形态发生蛋白2与跨膜受体结合激活，诱导Smad1/5/8的磷酸化，后者与Smad4形成复合物，调节成骨细胞分化相关靶基因的转录（Gomez-Puerto等人，2019年）。这两种通路之间存在广泛的相互作用，它们的协同激活显著增强了成骨效果。此外，破骨细胞的形成主要由RANKL/RANK/OPG信号轴调节：受体激活因子NF-κB配体与其在破骨细胞前体细胞上的受体结合以启动分化，而骨保护素则作为诱饵受体抑制这种结合，从而抑制破骨细胞的形成。值得注意的是，Wnt/β-连环蛋白和BMP/Smad通路也被报道可以通过调节成骨细胞中的受体激活因子NF-κB配体和骨保护素的表达来间接调节破骨细胞的形成（Haxaire等人，2016年），尽管LF-HD是否通过这些通路发挥骨调节作用尚未得到证实。
目前尚不清楚LF-HD相对于其同源物LF-HY是否具有更强的成骨生物活性。LF-HD的主要生物活性肽成分及其在骨代谢中的精确调节机制仍大部分未明确。此外，这些肽是否可以通过调节关键的成骨信号通路和RANKL/RANK/OPG系统来同时促进成骨和抑制破骨细胞介导的骨吸收，也尚未系统探索。此外，它们在临床前骨质疏松症动物模型中的骨保护效果也尚未完全阐明。解决这些关键科学问题对于推进安全创新抗骨质疏松症疗法的发现和发展具有重要意义。
本研究旨在系统探索疏水乳铁蛋白肽YIYT对骨代谢的调节作用及其背后的分子机制。通过体外实验研究了该肽对成骨细胞功能的影响，并阐明了涉及的关键信号通路。体内实验评估了其在骨质疏松症模型小鼠中对骨代谢的改善效果，为YIYT作为预防和治疗骨质疏松症的候选生物活性肽提供了实验和理论依据。
材料
MC3T3-E1亚克隆14成骨细胞来自中国科学院细胞库（中国上海）。细胞培养试剂，包括α-MEM培养基（Cat#12571048）、胎牛血清（FBS，Cat#ST30-3302）、青霉素-链霉素（Cat#15140122）和胰蛋白酶-EDTA（Cat#25200056），均购自Gibco（Thermo Fisher Scientific）。牛乳铁蛋白（LF，纯度≥95%）由山东兰利公司提供。用于模拟消化的酶（胃蛋白酶Cat#CZ0211、胰酶）
乳铁蛋白水解产物的疏水特性和分子量分布
乳铁蛋白的酶解效率及其水解产物的结构是其生物活性的关键前提（Moon等人，2017年）。作为肽化合物的关键物理化学性质，分子量和疏水性在调节其细胞功能效力方面起着决定性作用——这与先前的研究结果一致，即“肽的生物功能受其结构特性的影响”。在本研究中，
结论
本研究证实，从乳铁蛋白衍生的疏水肽YIYT可以通过促进Wnt/β-连环蛋白和BMP/Smad通路以及调节RANKL/OPG轴来发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用。它在去卵巢小鼠中有效改善了骨代谢，并且在体内具有良好的安全性。与传统药物相比，YIYT具有天然来源、小分子量和低毒性。其双重调节机制
作者贡献声明
马晓宇：写作 – 审稿与编辑。洪达：写作 – 审稿与编辑、数据分析。常志辉：写作 – 初稿撰写、方法学设计、实验设计、资金获取、概念构思。杜明：写作 – 审稿与编辑、资源协调、项目管理、方法学设计、资金获取。程淑珍：写作 – 审稿与编辑、资源协调、方法学设计、概念构思。傅百峰：数据可视化、数据管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32472274）、辽宁省科技计划联合项目（2024-MSLH-035）以及教育部乳品质量安全控制技术工程研究中心的开放项目（编号RK202302）的财政支持。
