《Food Chemistry》：Heteroaptamer recognition mediated strand displacement amplification for efficient electrochemical analysis of beta-2-microglobulin in breast milk
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本研究开发了一种基于异源aptamer识别的链置换扩增电化学检测方法，用于高灵敏度（检测限0.2 fg/mL）、特异性检测母乳中的β-2微球蛋白（B2M），并通过G-四联体结构增强信号响应，可区分复杂样本中的目标蛋白。
唐雅琴|何婷婷|潘林伟|王彦妮|李晓龙|赵霞|李大秀|窦宝婷
重庆理工大学药学与生物工程学院，中国重庆400054
摘要
人乳蛋白β-2-微球蛋白（B2M）作为婴儿的诊断生物标志物起着至关重要的作用，但传统的检测方法通常依赖于复杂的仪器，这些仪器在灵敏度和选择性方面存在局限性。本文描述了一种创新的异源适配体识别介导的链置换扩增技术，用于母乳中B2M的电化学分析。两种异源适配体分别与B2M上的不同位点结合，从而在磁珠上引发链置换反应，便于重复使用异源适配体/B2M复合物。这种分子机器的运作在传感界面诱导形成了大量的G-四链结构，这些结构能够与血红素结合，产生显著增加的电流，从而实现B2M的检测，其检测限为0.2 fg/mL。凭借其独特的能力，该传感器能够区分目标B2M与其他非目标蛋白质，确保在乳样中特异性地检测到B2M。通过使用合适的适配体/配体组合，该系统还可以用于检测其他目标物质。
引言
母乳是乳腺的杰出产物，是婴儿的主要食物来源。母乳中的宏量和微量营养素，包括蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、矿物质和维生素，占总重量的12%（D'Alessandro等人，2010年；Yang等人，2023年）。这些生物活性因子对婴儿的生长、免疫系统和认知发展、抵御病原体以及维持有益的肠道微生物群至关重要（Pallarés等人，2024年）。其中，人乳蛋白对婴儿尤为重要。研究表明，母乳中的β-2-微球蛋白（B2M）水平在哺乳期母亲与非哺乳期母亲之间存在显著差异（Mangé等人，2013年；Mouafo等人，2017年）。研究发现，母乳中的B2M浓度可以准确预测母乳喂养期间人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的传播风险。此外，B2M还被确定为多种疾病的预后生物标志物，包括肾脏相关疾病、糖尿病、多发性骨髓瘤和心脏病（Argyropoulos等人，2017年；Han等人，2022年；Jung等人，2015年）。长期接触重金属（如镉）导致肾衰竭的个体的体液中B2M水平较高（Kim等人，2015年；Monteiro等人，2016年）。B2M作为诊断、监测反应、治疗和移植中的生物标志物所起的关键作用凸显了其临床重要性。
免疫浊度测定法在临床实践中被广泛用于检测B2M，该方法依赖于抗原-抗体之间的直接结合形成二元复合物（Kolajo & Onilude，2019年；Ryu等人，2024年）。然而，由于特异性有限，这种方法可能会出现假阳性结果。随后开发了夹心免疫测定法以提高B2M检测的灵敏度和准确性（Hu等人，2024年；Yang等人，2017年），但这种方法的识别需要底物具有两个以上的不同抗原表位或多个相同的重复表位，这限制了其在临床复杂样本中的应用（Barhoum等人，2023年；Li, Xi等人，2024年）。近年来，适配体因具有抗降解性、易于合成和低免疫原性而越来越受到青睐，常用于检测蛋白质、细胞受体和生物分子（Li, Chen等人，2025年；Li, Gao等人，2025年；Yang等人，2024年）。通常，适配体通过单一适配体识别策略用于B2M的检测（Ma等人，2020年），但这种方法往往缺乏足够的识别特异性和结合能力，导致假阳性率增加和精度降低。为了提高对B2M的识别能力，研究人员开发了一种使用两种不同序列的适配体来靶向同一B2M分子的异源序列适配体识别策略（Tang等人，2025年）。分子对接模拟验证表明，这些适配体主要通过氢键、静电相互作用和疏水力与B2M蛋白上的不同位点结合。此外，实时荧光实验显示，异源适配体识别策略的淬灭效率优于单一或同源适配体识别策略，显示出更高的灵敏度和目标识别效果（Tang等人，2025年）。通过使用这种双位点结合技术，克服了传统检测方法的局限性，提高了检测的准确性和可靠性。
熵驱动电路是一种方便且稳定的扩增电路，其动力来源于释放分子的熵增益（Deng等人，2024年；Dou等人，2024年；Li, Gong等人，2024年；Yu等人，2025年）。自2007年的开创性研究以来，熵驱动DNA电路在分子检测、逻辑分析和纳米结构组装领域得到了广泛应用（Lu等人，2024年；Luo等人，2025年；Qiu等人，2025年；Xie等人，2025年）。它们的广泛应用归功于其出色的催化效率、信号放大能力和可定制的网络。例如，一种基于熵驱动的DNA电路在DNA框架纳米机器上实现了对临床血清样本中血清素的敏感检测（Dou等人，2025年）。然而，传统的熵驱动电路常常会导致DNA产物的浪费，从而影响后续反应的效率。
在这里，我们构建了一种高效的电化学生物传感器，通过异源适配体识别介导的链置换扩增策略，实现对复杂乳样中B2M的敏感检测，从而最大限度地提高扩增效率而不浪费反应产物。与传统方法相比，所设计的电化学生物传感器具有三个显著优势：首先，通过回收异源适配体/B2M复合物和有效利用DNA产物实现了最佳扩增效率；其次，异源序列适配体策略通过多点协同结合，有望显著提高特异性；此外，该传感器还能利用相应的亲和对检测其他蛋白质。
化学试剂
磁珠（MB，100 nm）经过链霉亲和素修饰，购自BaseLine ChromTech研究中心（中国天津）。血红素、三（羟甲基）甲基氨基甲烷（Tris）、6-巯基-1-己醇（MCH）、三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）和4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸钠盐（HEPES）由Aladdin Reagents（中国上海）提供。血红素溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制成储备溶液（1 mM），并储存在-20°C下。
异源适配体识别介导的信号放大策略
图1直观展示了用于B2M敏感检测的异源适配体识别介导的信号放大方法。传感器设计中的G-四链形成序列分为两部分，分别整合到CP链的5′端和GP1及GP2的3′端。电极表面修饰的CP链包含长茎区域，以保持发夹结构的相对热力学稳定状态。
结论
总之，本研究介绍了一种利用异源适配体识别进行链置换扩增的创新方法，用于电化学检测B2M。该传感策略实现了0.2 fg/mL的检测限，提供了一种灵敏且经济高效的检测方法。该方法能够区分B2M与其他干扰物质，并在复杂的乳样中实现准确检测。
CRediT作者贡献声明
唐雅琴：撰写——原始草案、方法学设计、研究实施、概念构思。何婷婷：验证、数据分析、数据管理。潘林伟：验证、数据分析、数据管理。王彦妮：验证、数据分析。李晓龙：验证、数据分析。赵霞：验证、数据分析。李大秀：撰写——审稿与编辑、资金申请、数据管理。窦宝婷：撰写——审稿与编辑、项目监督、项目管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（22404067、22307012、22404011）、重庆市科学技术委员会（2024NSCQ-MSX0382）、重庆市科技创新重点研发计划（项目编号2024CCZ096）以及重庆市研究生科学研究与创新基金（CYS25762）的支持，同时还得到了贵州省教育厅2024年自然科学研究项目（青年科技项目）的资助。
