《Food Research International》：Screening and application of flavor-enhancing functional strains for low-salt fermentation of chili
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低盐发酵辣椒中筛选出具有增强香气的乳酸菌R3（Lactiplantibacillus plantarum）和酵母J1（Meyerozyma guilliermondii），二者分别产生76和74种挥发性有机物，显著提升香气复杂度，其中R3的关键香气物质占比达18.42%，J1的酯类占比36.91%，感官评分均优于传统自然发酵组。
Youjin Yi|周玉杰|张志伟|何子宇|黄斌|肖宇|胡楠|曹曦|黄家丽
湖南农业大学食品科学与技术学院，长沙410000，中国
摘要
为了解决传统高盐发酵辣椒中水资源浪费、营养成分流失以及自然发酵风味不稳定等问题，本研究从室温下自然发酵的8%低盐辣椒中分离并筛选出了能够增强香气的功能性细菌，并进一步探讨了它们在低盐辣椒发酵中的应用。通过梯度稀释和涂布平板法，共分离出11株乳酸菌（R1–R11）和7株酵母（J1–J7）。根据菌落形态以及生理生化特性（乳酸菌的产酸能力和抗菌活性、酵母的气体产生能力、膜形成能力及耐酸性），选出了3株优秀的乳酸菌（R3、R4、R5）和1株酵母（J1）。对照组包括室温自然发酵（CK1）、32°C下未接种的发酵（CK2）以及一种市售的18%高盐脱盐调味品（CK3）。将选定的菌株在32°C、低盐条件下进行单菌株发酵，分析了发酵15天后辣椒的香气和品质。分子鉴定确认R3株为Lactiplantibacillus plantarum，J1株为Meyerozyma guilliermondii。在挥发性化合物分析中，R3组产生了76种挥发性有机化合物（VOCs），其中14种具有关键香气（相对气味活性值rOAV ≥1），远高于CK1（11种）、CK2（13种）和CK3（10种）。特征性香气化合物如d-limonene、geranylacetone和hexanal的含量显著增加，酸类（32.37%）和酯类（22.09%）的贡献尤为突出。J1组产生了74种VOCs，其中14种具有关键香气，酯类占比达到36.91%，高于CK1（16.29%）、CK2（18.10%）和CK3（33.46%）。独特的香气化合物如1-nonanol、苯甲醇和芳樟醇也很明显。感官评价显示，R3组的香气评分仅次于CK3组，而J1组因其富含酯类的香气而受到好评。相比之下，CK1组和CK2组的香气质量较差，CK1组含有少量不良的癸酸，CK2组产生了异味3-甲基丁酸，且两组都以烷类为主（分别为30.97%和31.72%，对香气贡献较小）。总体而言，R3（Lactiplantibacillus plantarum）和J1（Meyerozyma guilliermondii）显著提升了低盐辣椒发酵的香气复杂度和品质。这些菌株作为功能性发酵起始菌具有潜力，为低盐辣椒发酵提供了理论支持和微生物资源。
引言
作为传统的辣椒制品，发酵辣椒因其辛辣、酸爽和酥脆的口感而受到欢迎，能够刺激食欲（Shi等人，2022年）。然而，传统自然发酵的局限性，如生产规模小、发酵周期长、微生物群落未知、容易产生不良风味以及品质难以控制，使得难以满足日益增长的商业需求（Yin等人，2020年）。此外，自然发酵的辣椒通常需要较高的盐浓度（>18%）来抑制腐败微生物，这种工艺被称为“高盐发酵”（Wu等人，2021年；Ou等人，2014年；Yang等人，2022年）。虽然这种方法有效，但也存在一些缺点：大量用水进行脱盐会导致营养成分流失，产生大量含盐废水造成环境污染，并且需要后续的配方调整。因此，在保证安全和风味质量的同时降低盐含量已成为现代发酵辣椒加工的关键方向。
低盐发酵策略已在多种蔬菜系统中得到成功应用，例如中国苤蓝，通过将盐浓度降至4%并结合低温条件，改善了口感和挥发性风味，同时抑制了异味的产生（Chen等人，2023年）。低盐发酵（≤8%盐）是一种可持续的替代方案，但同时也带来了新的挑战，即在初期阶段增加了腐败和病原体繁殖的风险（Dai等人，2026年）。使用定义明确的起始菌进行接种发酵可以通过快速酸化环境来确保安全性（Geng，2021年）。此外，在低盐发酵系统中，特定乳酸菌（LAB）的接种已被证明能显著提升风味的复杂度和多样性（Tian等人，2026年）。尽管发酵辣椒的微生物多样性和风味特征已得到广泛研究（Chen等人，2021年；Geng，2021年），但大规模工业应用仍较为有限。目前大多数研究集中在从自发发酵中分离出优秀的乳酸菌（LAB）并将其作为起始菌使用（Tian等人，2026年）。
然而，过度依赖单一菌株的接种，特别是Lactiplantibacillus plantarum，已被证明会降低微生物的复杂度并对风味发展产生负面影响（Tang等人，2023年）。多项最新研究表明，单一菌株发酵会抑制本土酵母种群并减少关键挥发性化合物的合成。例如，比较了Lactobacillus acidophilus、Lacticaseibacillus rhamnosus和Pediococcus acidilactici单菌株发酵与混合菌株发酵的大豆残渣中的挥发性风味物质，发现单菌株发酵的大豆残渣中的风味物质种类较少（Saadoun等人，2021年）。单一乳酸菌只能产生其特有的风味特征，而无法参与所有风味形成的途径（Zhang、Shang等人，2023年）。
为了解决这一风味复杂性的问题，乳酸菌（LAB）与酵母的协同共发酵引起了广泛的研究兴趣（He等人，2023年）。例如Rhodotorula mucilaginosa等酵母是关键芳香化合物（如苯乙基酒精）的优质生产者，能显著提升整体风味复杂度。这突显了酵母在风味形成中的不可或缺但常被忽视的作用，而在仅使用乳酸菌的发酵过程中这一作用往往被忽视（Wang等人，2023a，2023b）。
低盐发酵过程中的微生物演替进一步证明了多菌株起始菌的必要性。微生物组成受原材料、地区、季节和发酵阶段的影响。优势菌属包括Firmicutes（Lactobacillus、Leuconostoc）和Proteobacteria（Enterobacter、Rosenbergiella、Pseudomonas），它们在发酵过程中不断竞争（Zhao等人，2016年）。在低盐发酵过程中，Weissella的初期优势会迅速降低pH值，创造有利于乳酸菌繁殖的酸性环境并抑制杂菌生长（Wang等人，2023a，2023b）。随着发酵的进行，耐盐菌种如Halomonas、Vibrio halophilus和Chromohalobacter可能会因盐度和酸度水平的变化而出现（Chen等人，2021年）。真菌群落虽然较少，但在功能上具有重要意义。早期以Hanseniaspora为主，20天后逐渐转变为Pichia、Debaryomyces和Candida，这与风味发展的峰值阶段相吻合（Zhao等人，2016年）。Saccharomyces在发酵后期逐渐占主导地位，体现了其适应性和代谢贡献（Zhao等人，2021年）。鉴于发酵辣椒中的风味物质主要由乳酸菌和酵母代谢产生（Janiszewska-Turak等人，2022年），探索它们在风味增强起始菌中的应用至关重要。
然而，目前尚缺乏选择这类风味增强菌株的战略框架。关键在于有效的筛选必须平衡功能要求和风味潜力。首先筛选出具有强产酸能力的菌株至关重要，因为这能确保候选菌株在发酵过程中占据主导地位，降低pH值以确保安全，并为后续的风味反应创造生化条件。未能通过这一基本测试的菌株，无论其香气潜力如何，都是不实用的。随后需要对其香气产生能力进行直接评估，以识别真正的风味增强菌。
因此，本研究旨在通过（1）从自然发酵辣椒中分离乳酸菌和酵母菌株，并采用顺序筛选策略（首先关注酸化能力，然后关注风味产生），（2）研究它们对低盐发酵辣椒挥发性风味的影响，来填补这一空白。研究结果有望为开发针对性的起始菌提供科学依据，从而提高发酵辣椒的风味质量并推动其工业化生产。
材料
用于菌株分离和筛选的样品是由X公司提供的室温自然发酵辣椒（8%（W/W）低盐度）。辣椒（Capsicum frutescens）购自湖南农业大学东芝园农场市场。Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Salmonella由湖南农业大学食品科学与技术学院的微生物实验室提供。使用MRS（De Man, Rogosa and Sharpe）和PDA（Potato Dextrose）培养基。
乳酸菌的菌落和细胞形态
从发酵辣椒中获得了11株具有CaCO3溶解能力、过氧化氢酶阴性反应、无孢子且革兰氏阳性染色的乳酸菌。菌落不透明，呈凸起或略微凸起，颜色从白色到奶油色或淡黄色不等。挑选一个菌落可得到类似酸奶的质地。细胞呈杆状或短杆状，单独存在、成对出现或形成短链。这些菌株初步被命名为R1–R11。具体的菌落形态和细胞形态如下所示
结论
从室温下自然发酵的8%盐分辣椒中，我们分离出了11株乳酸菌（R1-R11）和7株酵母（J1-J7）。乳酸菌R3、R4和R5表现出强烈的酸化能力和对E. coli、S. aureus和Salmonella的有效抑制作用，其中R3的抗菌活性最强。酵母J1的气体产生量极少，无膜形成，且耐酸性良好。在单菌株低盐发酵中，R3在15天后获得了最佳的风味和口感评分（85.80分）
CRediT作者贡献声明
Youjin Yi：撰写 – 审稿与编辑、方法学、实验设计。Zhou Yujie：软件应用、方法学。Zhiwei Zhang：验证、软件应用。Ziyu He：撰写 – 审稿与编辑、软件应用。Bin Huang：监督、资源管理、数据整理。Yu Xiao：实验设计、数据分析。Nan Hu：数据可视化、方法学、实验设计。Xi Cao：数据可视化、验证、监督。Jiaoli Huang：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据整理、概念构建。
未引用参考文献
Calani等人，2021年
Wang等人，2024年
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了湖南省重点研发项目（2024JK2142）、广西农业职业技术学院高层次人才引进科研项目（XKJ2522）以及广西农业职业技术学院工业创新团队专项项目（XTKJ2515）的支持。
