当归4-香豆酸∶辅酶A连接酶基因家族的鉴定与功能表征

　　

摘要：

目的 探究4-香豆酸∶辅酶A连接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase, 4CL）在当归根部木质素生物合成中的作用，为通过遗传改良或栽培手段定向调控当归药材品质奠定基础。 方法 通过生物信息学方法鉴定当归4CL基因家族，开展蛋白理化性质、二级结构预测、基因结构、启动子顺式作用元件以及系统进化分析，通过大肠杆菌异源表达和体外酶活验证基因功能，利用实时荧光定量PCR分析基因表达特征。 结果 在当归基因组中共鉴定到12个As4CLs，编码415?572个氨基酸，相对分子质量在45?62 kD，等电点范围为5.47?9.06，二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。系统进化分析将As4CL6与As4CL7归在Group I，其余As4CLs均属于Group Ⅲ。氨基酸序列比对结果显示As4CLs含有2个功能保守结构域Box I和Box Ⅱ。启动子分析结果显示，As4CLs基因含有丰富的光响应元件、激素响应元件及非生物胁迫响应元件；体外酶活实验证明As4CL6与As4CL7均能够催化4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸生成相应的辅酶A硫酯，且两个酶均对阿魏酸的亲和力最强；RT-qPCR结果显示As4CL6和As4CL7在当归抽薹根部的表达量高于未抽薹根部。 结论 成功克隆了As4CL6与As4CL7基因，通过体外酶活实验证明2个重组蛋白对3种底物均具有催化活性。