基于CRISPR/Cas9技术制备NCAPG基因敲除牛成纤维细胞系

　　

摘要：

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建NCAPG基因敲除的牛胎儿成纤维细胞模型，并探究NCAPG基因缺失对细胞活性的影响。 方法 在牛NCAPG基因转录本第6外显子区域设计特异性sgRNA，将其与SpCas9蛋白孵育形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过电转染技术将RNP复合物导入牛胎儿成纤维细胞。随后采用ClonePlus?技术进行单克隆分离培养，经PCR扩增和测序验证后成功获得NCAPG基因敲除的阳性单克隆细胞株。 结果 ICE软件分析表明，sgRNA的敲除效率达到49%；TA克隆测序结果证实，所获得的单克隆细胞均为杂合子，其靶位点存在5 bp的缺失突变；Western blot检测显示，与野生型细胞相比，敲除细胞株中NCAPG蛋白表达水平极显著降低（P<0.01）；CCK-8细胞活性检测结果表明，NCAPG基因敲除显著抑制了细胞增殖能力（P<0.01），表现为细胞生长速率明显减缓。 结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建了牛胎儿成纤维细胞NCAPG基因高效敲除方法，并证实NCAPG基因缺失会显著抑制细胞活性，为深入研究牛NCAPG基因的功能及其分子机制提供了重要的实验材料。