《International Journal of Biological Macromolecules》：Development and application of NanoLuc-based LIPS assay for antibody detection of orthohantavirus infections and vaccine responses
编辑推荐：
正确定序病毒（OHV）检测技术开发及性能验证，采用NanoLuc-LIPS方法检测10种OHV核蛋白抗体，通过142份血清样本比较显示其灵敏度97.10%、特异性98.63%，动态范围达4.05×10^7倍，适用于HFRS疫苗评估和疫情监测。
陈胜尧|李玉琼|赵杰斌|赵凯|魏荣|刘正祥|李思宇|王健|吴月春|陈贵军|周俊民|郭晓琴|谭志华|张云志|邵宗提|杨兴楼
中国科学院昆明动物研究所，云南省人畜共患病病毒国际联合实验室，遗传进化与动物模型重点实验室，云南昆明，650223，中国
摘要
正汉坦病毒（OHV）被世界卫生组织（WHO）列为具有高度公共卫生紧急事件风险的优先病原体，可引发严重疾病，如肾综合征出血热（HFRS），并对公共卫生构成持续威胁，尤其是在汉坦病毒（HTNV）和首尔病毒（SEOV）流行的中国。此外，新发现的病毒如泸西病毒和伏贡病毒也构成潜在威胁，这进一步凸显了加强监测的必要性。为克服现有方法的局限性（如检测窗口窄和生物安全限制），我们开发了一种基于NanoLuc的荧光素酶免疫沉淀系统（LIPS）检测方法，用于检测十种OHV的核蛋白。该方法通过分析142份HFRS患者、接种疫苗者、其他患者（SFTS患者和 scrub typhus 患者）及健康对照组的样本，从敏感性、特异性、一致性及统计系数等方面对ELISA和胶体金检测方法进行了系统评估。应用于临床HFRS患者和接种疫苗者时，LIPS方法显示出优异的敏感性（97.10%）、高特异性（98.63%）、宽动态范围（4.05 × 10^7 倍稀释度）以及与参考检测方法的高度一致性（97.89%），同时还能检测到剂量和性别特异性的抗体反应。我们的研究结果表明，LIPS是一种可靠的高通量工具，适用于血清流行病学调查和疫苗评估。通过实现精确的抗体分析并扩展监测能力，该方法为应对流行地区的OHV威胁提供了重要进展。
引言
汉坦病毒，尤其是正汉坦病毒（OHV），最近被世界卫生组织列为具有高度公共卫生紧急事件风险的优先病原体，在全球公共卫生领域受到了广泛关注[1]、[2]。与人类疾病相关的OHV通常来源于啮齿动物。人类感染OHV后可能发展为两种主要临床综合征：肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（HCPS）[1]。HFRS由大约十种OHV引起，包括汉坦病毒（HTNV）、首尔病毒（SEOV）和普马拉病毒（PUUV），这些病毒在中国、韩国、俄罗斯和北欧国家等地流行[3]、[4]。而HCPS则由四种OHV引起，如安第斯病毒（ANDV），该病毒在南美和美国西南部地区流行[5]。根据新兴疾病监测计划（ProMED）的数据，全球每年约有7万至10万例感染病例[6]。这些疾病日益被视为全球公共卫生的重大挑战。其中，HFRS占所有报告病例的约90%，死亡率在1%到15%之间[7]、[8]。
中国是HFRS（主要是HTNV和SEOV）的关键流行区域[9]。该疾病主要发生在中国的西南部、东北部和中部地区[10]。近年来，发现了几种新病毒，如伏贡病毒（FUGV）、泸西病毒（LUXV）、梁河病毒（LIHV）和新义病毒（XIYV），这些病毒从Eothenomys eleeusis、Eothenomys miletus和Anourosorex squamipes中分离出来[7]、[11]、[12]、[13]。总之，关键自然疫源地持续存在的威胁以及新病毒的不确定性风险，迫切需要加强流行病学监测，并开发快速高效的检测技术。
HFRS的常规诊断主要依赖于两种方法：病因诊断（核酸检测、病原体分离和序列分析）和血清学诊断（抗体检测）[14]。根据专家共识，HFRS的诊断金标准包括以下任一条件：1）检测到抗汉坦病毒IgM抗体；2）检测到汉坦病毒RNA；3）患者康复期IgG抗体水平比急性期增加5倍以上；4）成功分离出病毒[14]。核酸检测是临床和流行病学研究中的主要方法。然而，该方法的检测窗口受到患者体内病毒RNA短暂存在的限制[15]。虽然在急性期几乎可以达到100%的检测效率，但康复后病毒RNA通常会降至检测限以下，导致轻度或无症状患者的诊断漏诊率较高[15]。此外，由于病毒RNA载量低，轻度或无症状感染者在常规HFRS监测中常被遗漏。这些个体在核酸检测中可能呈阴性，但在血清学检测中呈阳性。因此，血清学方法对于识别过去的感染和潜在的未诊断病例具有重要意义。此外，基于抗体的检测方法具有更长的可检测窗口，不受严格时间限制，因为IgG抗体可以持续数月甚至数年[16]。这使得血清学检测更适合大规模流行病学调查和汉坦病毒感染的监测。
目前的血清学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫测定（CG）、免疫荧光测定（IFA）和病毒微量中和试验（VNT）[16]。ELISA和CG在敏感性和特异性方面存在局限性，尤其是在检测IgM抗体时[17]，而IFA和VNT需要高级别的生物安全设施[16]。最近，荧光素酶免疫沉淀系统（LIPS）已被用于临床诊断和流行病学监测，如HIV、SARS-CoV 2、SFTSV[18]、[19]、[20]，其优势在于高敏感性和良好特异性。LIPS方法利用重组融合蛋白（包含病毒蛋白和Nano luciferase作为报告分子）[19]。通过蛋白质A/G相互作用，捕获抗体-重组蛋白复合物，然后根据荧光素酶的发光强度进行定量和定性评估。
为满足这些需求，我们开发了一种新的LIPS抗体检测方法，用于检测针对多种OHV的抗体，包括在中国发现的自然流行病毒和新发现的病毒。通过检测阳性个体（HFRS患者和接种疫苗者）的抗体，并与其他传统血清学方法进行比较分析，建立了区域性的OHV暴露监测平台。
十种选定OHV核蛋白（NP）的特征分析
在本研究中，我们尝试开发一种基于荧光素酶的抗OHV抗体检测方法，用于检测十种不同的OHV。荧光素酶免疫沉淀系统（LIPS）结合NanoLuc荧光素酶和传统的LIPS流程（图1A）。选择HTNV、SEOV、SERV、LUXV、FUGV、CABV、LIHV、XIYV、ANDV和PUUV作为LIPS检测的目标抗原。这些病毒因其流行潜力或相关疾病而被选中。
讨论
OHV被WHO列为具有高度公共卫生紧急事件风险的优先病原体，对全球公共卫生构成重大挑战[2]。这些病毒每年在全球范围内导致多达7万例严重疾病（HFRS和HCPS）的病例[1]、[6]。中国是HFRS的关键流行区域[9]、[21]、[22]，HTNV和SEOV在此流行，同时还有新病毒如FUGV和LUXV[11]和LUXV[12]。随着新发和再发传染病的不断出现，血清学检测方法变得越来越重要
结论
总之，我们开发并验证了一种基于NanoLuc的LIPS方法，用于敏感且特异地检测OHV抗体。该方法无需纯化即可实现快速、高通量的筛查，在检测低滴度和多种类型的抗体方面优于传统方法，具有高敏感性、高特异性、宽动态范围和低成本的优势。在HFRS患者和疫苗接种者的研究中，该方法揭示了剂量和性别依赖性的免疫反应，证明了其实用性
作者贡献声明
陈胜尧：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，概念化。李玉琼：资源获取，调查，数据分析。赵杰斌：可视化，方法学，调查。赵凯：资源获取，调查。魏荣：验证，调查。刘正祥：资源获取，调查。李思宇：资源获取，调查。王健：资源获取，调查。吴月春：调查。陈贵军：项目管理。周俊民：撰写 –
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：杨兴楼表示获得了国家自然科学基金的财政支持。杨兴楼还表示获得了云南省基础研究项目的财政支持。陈胜尧表示获得了彩云博士后计划博士后创新项目的财政支持。
致谢
我们衷心感谢国家病毒资源中心及邓飞教授提供的HFRS患者血清样本。
本研究得到了国家自然科学基金（U2202216）、云南省基础研究项目（202501AS070121、202301AS070068）、彩云博士后计划博士后创新项目以及云南1Revitalization Talent Support Program Young Talent Project（XDYC-QNRC-2022-0769）和青年创新促进协会的支持。
