《Bioconjugate Chemistry》：Enhancing Enzymatic Bioconjugation Efficiency via Computer-Based Installation of a Substrate Recruitment Domain
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为了提升宽谱性酶（如酪氨酸酶）的底物选择性并增强其催化效率，研究人员利用计算设计将底物招募域(SRD)与酪氨酸酶融合，成功构建了名为design42 (D42)的工程酶。该酶可高效、高选择性地识别含有特定识别序列的多肽底物，将其酪氨酸残基氧化为邻醌，进而实现与小分子（如细胞毒性药物）的共轭。该方法有效解决了酶促生物共轭中非特异性修饰和位点难以修饰的挑战，为快速制备抗体药物偶联物(ADC)等提供了新策略，具有重要的应用前景。
在生物医学研究的工具箱中，酶促生物共轭是一项关键技术，它允许科学家们在温和的条件下，将不同分子精确地连接在一起。这项技术在药物开发、蛋白质功能研究、诊断试剂制备等领域扮演着核心角色。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)作为一种催化酪氨酸氧化为高活性邻醌(orthoquinone)的关键酶，因其宽泛的底物谱和可兼容多种亲核试剂（如硫醇、氨基、腈氨酸等）的特性，成为构建蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子偶联物的理想生物催化剂。然而，机遇与挑战并存。酪氨酸酶的“宽谱性”如同双刃剑，在为反应提供便利的同时，也带来了不理想的脱靶修饰风险。此外，当目标酪氨酸残基位于空间位阻较大或静电位点不佳的环境中时，酶的催化效率会显著下降，这使得在复杂的生物分子（如抗体）上实现高效、特异的定点修饰变得尤为困难。面对这些瓶颈，如何在保留酶活性的前提下，赋予其精准的靶向能力和克服不利修饰环境的能力，成为该领域亟待突破的难题。为此，研究人员将目光投向了自然界中广泛存在的智慧——底物招募域(Substrate Recruitment Domain, SRD)。许多天然酶系统利用SRD来结合和定位特定的底物序列，从而在复杂的细胞环境中精准地提高局部底物浓度，并增强催化效率。受此启发，一支研究团队开展了一项创新性工作，他们尝试将计算设计与酶工程相结合，旨在为酪氨酸酶安装一个“智能导航”SRD，从而实现对特定底物序列的定向招募和高效修饰。这项研究成果已正式发表在《Bioconjugate Chemistry》期刊上。
为开展此项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，基于Rosetta的计算蛋白质设计，用于将Fyn-Src同源3结构域(SH3)作为SRD模型，并将其精确“对接”和融合到来自Bacillus megaterium的突变型酪氨酸酶(bmTyr)表面，设计了54个融合蛋白候选。其次，多肽合成与生化表征技术，包括合成了系列含有不同识别序列(RS)和核心基序(core)的定向及非定向多肽底物，并通过液相色谱-质谱联用(LC-MS) 和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 精确量化酶促羟基化和共轭反应的效率。再者，蛋白质晶体学，成功解析了最优设计D42的2.6 ?分辨率晶体结构，以验证计算模型的准确性。此外，还利用了荧光偏振技术测定酶与多肽的亲和力。最后，在应用层面，采用了哺乳动物细胞表达系统制备了工程化抗体（利妥昔单抗，Rituximab），并通过完整蛋白质质谱*分析了抗体药物偶联物(ADC)的生成与药物释放。
Rosetta Design of Tyrosinase with an SRD
研究人员以bmTyr*和Fyn-SH3的结构为起点，利用Rosetta软件进行多阶段计算设计。通过手动对接和基于能量的细化，将SH3结构域定位在酪氨酸酶活性位点附近，使其肽结合槽的方向能将结合肽的C末端指向活性位点。随后进行了刚性对接、界面两侧的序列设计以及连接子(linker)设计，从大量设计中筛选出54个进行实验验证。
Initial Experimental Screening
在表达的50个可溶性融合蛋白中，有49个保留了酪氨酸酶活性。通过以含有N末端APP12多脯氨酸基序和C末端酪氨酸的定向肽(peptide 1)为底物进行活性筛选，发现6个设计的活性优于亲本酶bmTyr*，其中Design 42 (D42)在1 μM和10 μM底物浓度下均表现出最高活性。荧光偏振实验证实D42对APP12肽具有高亲和力(Kd< 2 μM)。
Biophysical and Biochemical Characterization of D42
深入表征证实了SRD依赖的速率增强。D42对含有APP12基序的定向肽(peptide 1)修饰率显著高于对不含该基序的肽(peptide 2)。当使用酪氨酸位于N端的“错误导向”肽(peptide 3)时，D42未显示速率增强，而简单的融合蛋白(NF)则仍有增强，证明D42成功锁定了SRD的方向，实现了底物和位置的双重选择性。D42还能有效识别反向结合的VSL12基序(peptide 4)。当连接肽过短(peptide 5)导致底物无法同时结合SRD和进入活性位点时，速率增强消失，验证了“双位点协同结合”机制。更重要的是，D42能够高效修饰位于空间位阻大(peptide 7)或静电位点不利(peptide 8， EEEEY)环境中的酪氨酸，而这些位点对bmTyr而言是难以修饰的。浓度梯度实验显示，D42在低底物浓度(100 nM)下相比bmTyr有32.1倍的活性提升，且该优势随浓度升高而减弱。竞争实验进一步表明，即使在有非靶向底物存在的情况下，D42和NF在低浓度下也能优先修饰定向底物，且D42在100 μM时仍保持显著的选择性优势。
Crystal Structure of D42
D42的晶体结构显示，SH3结构域以设计的方位与酪氨酸酶相互作用，其肽结合槽的方向确实能将肽的C末端导向活性位点。尽管界面接触与设计模型有所偏差且界面面积较小，但整体结构和预期的肽导向性得以实现，证明即使中等稳定的域间相互作用也足以支撑SRD的功能。
Antibody Drug Conjugation
应用研究表明，D42能高效催化细胞毒性药物DM1和MMAE与定向肽的共轭，速度远超bmTyr。在抗体药物偶联(ADC)应用中，研究团队在利妥昔单抗轻链C末端引入了APP12基序和一个含有酪氨酸的核心基序(Rit-APP12-YA3)。D42能在10分钟内高效地将DM1偶联到该抗体的工程化酪氨酸位点上，产率约75%，而bmTyr的偶联效率极低。通过PreScission蛋白酶处理，可实现偶联药物载荷的定点释放。延长反应时间后，D42可实现100%的ADC产率，甚至观察到在同一酪氨酸上偶联两个DM1分子的现象，这有望提高药物的抗体比率(DAR)。此外，在长时间反应中，D42还能修饰抗体重链(HC)上靠近APP12延伸链的酪氨酸残基，展示了其在三级结构空间内临近位点的修饰潜力。
本研究得出结论，通过计算设计为酪氨酸酶安装一个空间约束的底物招募域(SRD)，是同时提高酶催化活性和底物选择性的有效策略。所获得的最优设计D42，不仅能够引导酶高效、特异地修饰带有特定识别序列的底物，还能克服空间位阻和不利静电环境对传统酶促修饰的限制。与简单的结构域融合(NF)相比，计算设计实现的SRD刚性固定带来了更优的底物招募效率、方向控制力和在高底物浓度下保持的选择性优势。这项研究的意义在于，它展示了一种通用的酶工程新范式：将底物结合与催化活性分置于两个功能独立的域，从而在不牺牲酶核心催化功能的前提下，通过理性设计实现对特定生物分子的精准靶向和高效修饰。这极大地扩展了酶促生物共轭的应用范围，特别是在抗体药物偶联物(ADC)的快速、定点制备方面展现出巨大潜力。该方法为开发下一代具有更高选择性、更强适应性的生物共轭工具酶奠定了基础，并为在复杂生物环境中实现精准的蛋白质功能操控提供了新思路。
