《Frontiers in Immunology》：Kappa free light chains in cerebrospinal fluid to detect inflammation - results from a multicentric prospective real-world study
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本研究评估了脑脊液（CSF）中κ游离轻链（FLCκ）检测在常规诊断中作为鞘内免疫球蛋白（Ig）合成生物标志物的价值。通过一项多中心前瞻性真实世界研究（ORCAS研究），结果提示FLCκ对预测鞘内Ig合成具有很高的阴性预测值（NPV），但其灵敏度（0.87）未达预设终点（>0.95）。因此，FLCκ目前尚不能单独作为鞘内炎症的预筛查标记物，但与常规检测（如鞘内Ig合成或寡克隆区带[OCB]）联用可提供额外价值。
引言
鞘内免疫球蛋白（Ig）合成的证据是中枢神经系统（CNS）炎症的一个指标。在当前常规实验室中，通常通过免疫球蛋白商数图或寡克隆区带（OCB）检测来评估鞘内Ig合成。κ游离轻链（FLCκ）是近年来被引入作为检测鞘内Ig合成的新型生物标志物，并已开发了用于识别病理性鞘内分数（IF）的双曲线FLCκ商数图。此前的研究表明，FLCκ鞘内分数在预测鞘内Ig合成方面具有高达98%的灵敏度，以及99.5%的排除阴性概率。基于此，研究人员设计了一种将FLCκ鞘内分数作为初步筛查步骤的工作流程，用以判断脑脊液（CSF）/血清样本对是否需要进行额外的Ig和OCB分析。本文报告的是一项多中心前瞻性生物标志物研究（ORCAS研究）的主要终点结果。
材料与方法
本研究纳入了德国6个参与ORCAS研究的实验室常规检测中收集的CSF和血清样本数据。研究遵循当地伦理研究委员会的声明，并基于诊断准确性研究报告标准（STARD）进行设计。研究方案已于2023年7月17日发布在medRxiv预印本服务器。
数据收集自2023年7月至2024年3月间，无论临床诊断问题如何，连续送检用于常规诊断的CSF和血清样本。由于主要终点是在所有获得的样本对中使用FLCκ检测鞘内Ig合成，因此未针对FLCκ在特定神经炎症性疾病中作为生物标志物的表现进行亚组分析。所有实验室检测，包括用于计算鞘内合成的血清和CSF中的白蛋白、Ig、FLCκ以及OCB分析，均根据各实验室的本地标准进行。数据在传输到主要研究地点（格赖夫斯瓦尔德大学医学中心）前进行了匿名化处理。
在传输的1052对CSF/血清样本数据中，共有624对符合纳入标准。169份因数据不完整或不符合人口统计学纳入标准（年龄＞18岁）被排除。另外256份因血清FLCκ高于参考范围而被排除。还有3份因血液污染被排除。对于CSF FLCκ值低于检测下限（LLOD）的样本（占总数的7.5%），用LLOD值进行了替换。研究通过已建立的FLCκ商数图计算了FLCκ及其鞘内分数的参考范围。鞘内免疫反应的存在被定义为：根据本地标准检测到CSF限制性OCB，或在相应的商数图中检测到IgG、IgM或IgA的鞘内分数。
在统计学分析方面，由于预期连续检测会导致鞘内体液免疫反应的患病率较低，因此将阴性预测值（NPV）和灵敏度共同定义为主要终点。样本量计算基于双侧置信区间（CI）的精确度，为确保总体α ≤ 0.05，应用了双侧97.5%的置信区间。期望精度定义为最大CI宽度为0.05。假设灵敏度和NPV均为95%，计算出需要424个样本来获得宽度为0.05的双侧97.5% CI。
结果
在最终分析的624个样本中，31% (n=194) 的样本FLCκ鞘内分数＞0%。其中，54% (n=104) 通过CSF限制性OCB和/或定量的鞘内IgG、IgA、IgM合成获得了额外的鞘内体液免疫反应证据。67% (n=415) 的样本既未检测到鞘内FLCκ合成，也未检测到鞘内IgG、IgA、IgM合成或CSF限制性OCB。有15个样本结果出现分歧，表现为FLCκ鞘内分数 ≤ 0%，但通过商数图检测到鞘内Ig合成或有CSF限制性OCB证据，其中7个样本有CSF限制性OCB，8个样本为孤立的鞘内IgM和/或IgA合成。
本研究的预设主要终点指标是，FLCκ鞘内分数＞0%用于检测（和排除）鞘内Ig合成的灵敏度需达到0.95，阴性预测值（NPV）也需达到0.95。结果显示，在119个通过常规诊断参数确认存在鞘内Ig合成的样本中，有104个被FLCκ鞘内分数＞0%检测到，其灵敏度为0.87（CI 0.81-0.93），低于预设的0.95阈值。而在FLCκ鞘内分数 ≤ 0%的430个样本中，有415个样本的常规诊断参数也为阴性，这表明FLCκ鞘内分数的阴性预测值为0.97（CI 0.95-0.98）。
在专门针对OCB的分析中，FLCκ鞘内分数检测CSF限制性OCB的灵敏度为0.93（CI 0.88-0.98），阴性预测值为0.98（0.97-1.0）。值得注意的是，使用Optilite平台/Binding Site FLCκ检测的样本中，有61% (n=54/89) 的测量值低于该检测特定的检测下限。
由于FLCκ指数已被纳入当前的多发性硬化（MS）McDonald诊断标准，研究也对该评估参数进行了额外分析。结果显示，在FLCκ指数截断值设为3.61时，其用于检测鞘内炎症的灵敏度或NPV与使用鞘内分数相比，无统计学显著差异。
讨论
这项多中心真实世界研究证实了FLCκ鞘内分数具有非常高的阴性预测值，与之前单中心研究显示的0.99的阴性预测值结果一致。然而，本研究发现，与已建立的常规诊断参数相比，FLCκ鞘内分数检测鞘内体液免疫反应的灵敏度仅为中等水平（0.87），未能复现先前单中心研究中0.98（发现队列）和0.97（验证队列）的高灵敏度结果。对FLCκ指数（I = 3.61，此数值被认为最适合检测与疾病无关的OCB合成）的分析也证实了这些发现。
在FLCκ鞘内分数呈假阴性结果的15个样本中，8个存在鞘内IgA或IgM合成，7个存在CSF限制性OCB。值得关注的是，鞘内IgM合成尤其容易因CSF中浓度低及其较高的血清梯度而导致比浊法测量不准确。孤立的假阳性IgM合成也可能在血液污染的情况下发生。此外，在两个使用Optilite?分析仪和Freelite?FLC kappa试剂盒的实验室中，获得的大部分CSF FLCκ数据测量值低于检测下限。使用相同平台和检测的其他研究也报告了高达64%的CSF FLCκ值低于检测下限。该观察结果的临床相关性仍有待确定。比较多克隆检测与单克隆检测的研究显示两者具有中等一致性。一项关于FLCκ指数在多发性硬化患者中应用的荟萃分析则未发现两种平台和检测之间存在统计学显著差异。
由于本研究的主要终点是检测鞘内Ig合成的灵敏度，因此排除了大量血清FLCκ水平较高的患者。这表明，在将FLCκ鞘内分数作为普通人群的预筛查工具时，存在漏诊假阴性结果的风险。基于以上发现，研究者得出结论：由于存在漏诊孤立性IgA和/或IgM合成或OCB的风险，目前尚不推荐将FLCκ鞘内分数作为初步步骤，用以筛选无需进行额外Ig定量和OCB分析的CSF/血清样本对的工作流程。此外，本研究旨在测试FLCκ作为鞘内合成的初步标志物，不区分潜在疾病，因此现有数据无法对其在多发性硬化中的应用做出结论。
总结
这是首项在常规条件下跨不同实验室评估FLCκ作为鞘内体液免疫反应标志物的多中心研究。本研究显示，FLCκ可作为初步标志物，用于识别鞘内体液免疫反应可能性极低的样本。然而，鉴于其仅为87%的有限灵敏度，我们（目前）不推荐单独使用FLCκ。为了获得最佳的诊断准确性和对个体患者鞘内体液免疫反应的全面评估，FLCκ分析应与包括鞘内Ig合成检测和CSF特异性寡克隆区带检测在内的成熟方法结合使用。
