《Frontiers in Endocrinology》：Long-term culture of patient-derived pheochromocytoma organoids
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（编者推荐）嗜铬细胞瘤（PCC）是一种罕见的神经内分泌肿瘤，一旦转移，治疗选择有限，且缺乏代表性的临床前模型。本研究首次成功建立并长期维持了源于患者PCC组织的类器官培养体系，证实其在体外培养早期保留了包括嗜铬细胞分化标志物（如CHGA、SYP）表达和分泌功能（检测到甲氧基肾上腺素）等关键肿瘤特征。尽管功能特性会随时间推移而减弱，但这项概念验证性研究为开发能用于疾病建模、药物筛选和个体化医疗的PCC体外模型平台奠定了重要基础。随着进一步优化，该模型有望推动针对这一罕见肿瘤的新疗法研发。
嗜铬细胞瘤（Pheochromocytomas, PCCs）是起源于肾上腺髓质嗜铬细胞的罕见神经内分泌肿瘤，通常与过量的儿茶酚胺分泌有关。与肾上腺外交感神经副神经节瘤（Paragangliomas, PGLs）一起，它们被归类为PPGL，是已知遗传倾向性最高的肿瘤之一。对于已发生转移的PCC患者，现有治疗选择十分有限，预后不良，总体死亡率高达53%。新疗法开发的主要障碍之一在于缺乏具有代表性、可扩展的临床前模型。传统的人源PCC细胞系难以建立，患者来源的异种移植（PDX）模型成功率不一且周期长，而基因工程动物模型通常只能模拟单一的遗传背景，难以捕捉PCC广泛的遗传和表型异质性。近年来，患者来源的类器官（Organoids）作为一种三维、自我更新的培养模型，因其能重现起源组织的关键特征，在疾病建模、药物筛选和个体化医疗中展现出巨大潜力。
这项试点研究的目标是建立并表征源于人类PCC组织的患者来源类器官培养体系。研究人员从两名接受肾上腺切除术的PCC患者（PCC1和PCC2）体内收集肿瘤组织样本，将组织消化为单细胞后，将其重悬于基底膜提取物（BME）中形成液滴，并覆盖包含多种生长因子（WREFLD: Wnt, R-spondin-3, EGF, FGF2, LIF, DHEAS，部分条件下加IGF2）的扩增培养基进行培养。结果显示，来源于两名患者的类器官均能维持培养数周并可连续传代。其中，PCC1来源的类器官在培养129天后传至第3代（传代间隔34-53天），PCC2来源的类器官在培养139天后达到第2代（传代间隔63天）。在蛋白质水平上，类器官同时表达干细胞/祖细胞标志物（巢蛋白Nestin、波形蛋白Vimentin、SOX10）和嗜铬细胞分化标志物（突触素Synaptophysin、CD56），但后者与原发性肿瘤组织相比表达显著降低。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测细胞培养上清中的甲氧基肾上腺素，证实了类器官在培养初期具有分泌活性，但其激素分泌水平会随时间推移而下降。在形态学上，类器官呈紧凑的球形结构，部分较大类器官的中心可见嗜酸性核心，外周环绕一层密集的、略呈细长形的细胞，而较小的类器官则细胞分布更均匀。此外，培养体系中还经常出现由细胞外基质丰富的区域和同心状排列的外周细胞带组成的致密细胞簇。
对PCC1来源的组织和类器官进行的免疫组织化学（IHC）分析表明，在类器官中，分化的嗜铬细胞标志物表达并不一致。嗜铬粒蛋白A（CHGA）染色未检测到，而突触素（SYP）和CD56仅在部分类器官中呈阳性。在致密细胞簇中，这些分化标志物的染色呈现弥漫、苍白的颗粒状模式，但在散在的单个细胞或小细胞群中可见明确的胞质染色，证实了嗜铬细胞的存在。相比之下，干细胞/祖细胞标志物（SOX10、Nestin、Vimentin）的表达更为一致。SOX10和巢蛋白染色主要定位于类器官和致密簇的外层细胞，而波形蛋白染色在两者中均呈现强烈而均匀的分布。Ki67染色显示，在类器官和致密簇的外层存在散在的增殖细胞。免疫荧光（IF）分析进一步支持了这些发现，在PCC2的P0和P1代类器官中检测到了分化标志物酪氨酸羟化酶（TH）和嗜铬粒蛋白A（CHGA），以及干/祖细胞标志物波形蛋白和巢蛋白。
定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，与原发性肿瘤组织相比，类器官和致密细胞簇中肾上腺髓质标志物（CHGA、SYP、PNMT、TH）的mRNA表达呈下降趋势，而干/祖细胞标志物（SOX10、NES、VIM、GFAP）的mRNA表达水平普遍更高，但差异无统计学显著性。TUBB3的相对基因表达水平柱状图。">
为了探索诱导PCC类器官分化的可能性，研究人员在PCC1的P3代类器官中尝试了用地塞米松（Dex）和/或佛波酯（PMA）进行处理。结果显示，在持续存在WREFLD生长因子的条件下，添加Dex能够支持最稳健的类器官形成，并且在该条件下，SYP的基因表达相较于仅用WREFLD的扩增条件有统计学意义上的显著上调，其他分化标志物也有上升趋势，但未达显著水平。
综上所述，本研究首次成功实现了人类PCC患者来源类器官的长期培养和连续传代。在培养早期，这些类器官保留了来源肿瘤的关键表型和功能特征，但随着时间的推移，其分化标志物表达和激素分泌功能逐渐减弱，这可能与类器官去分化、分化细胞选择性耗竭或培养条件引起的细胞应激有关。尽管存在功能特征随培养时间而减弱的局限性，且培养的扩增能力相对有限，但这项概念验证性研究为利用患者来源的PCC类器官模型研究疾病生物学、支持治疗开发奠定了基础。未来的研究需要优化培养条件以改善长期增殖和分化潜能，建立来自不同基因型肿瘤的类器官，并进行更深入的分子表征（如单细胞RNA测序），以推动该类器官模型在PCC的个性化药物筛选和治疗策略开发中的应用。
