《Frontiers in Immunology》：Comprehensive circRNA profiling of platelets and exosomes identifies hsa_circ_0061274 as a novel biomarker for lung adenocarcinoma
编辑推荐：
本文通过高通量测序比较了肺腺癌（LUAD）患者与健康对照的血小板和外泌体circRNA图谱，发现血小板circRNA数量是外泌体的15-20倍。筛选出稳定的内参基因hsa_circ_0001380，并验证了血小板来源的hsa_circ_0061274在LUAD患者中显著下调。在独立验证队列中，hsa_circ_0061274在区分LUAD与健康对照（AUC=0.85）、LUAD与良性肺结节（AUC=0.75）以及早期（I期）LUAD（AUC=0.68）方面显示出良好的诊断性能，证明了血小板circRNA作为LUAD微创早期检测和肺结节鉴别诊断生物标志物的潜力。
引言
肺癌是全球主要的健康威胁，多数患者在确诊时已处于晚期，5年生存率仅约20%。肺腺癌是肺癌最常见的亚型。目前诊断依赖影像学和组织病理学，后者具有侵入性且可能无法完全反映肿瘤异质性。液体活检（包括外泌体、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、肿瘤教育血小板等）因其微创、可实时监测等优势成为研究热点。其中，血小板作为无核细胞碎片，不仅参与止血，还被认为是功能性RNA的储存库，并能响应肿瘤信号改变其RNA含量，形成“肿瘤教育血小板”。环状RNA是一类共价闭合的单链非编码RNA，因其对核酸酶的高抗性和稳定性，成为有潜力的生物标志物。本研究旨在通过测序配对的血小板和血浆外泌体，比较两者的circRNA谱，并评估其作为LUAD早期诊断生物标志物的价值。
方法
本研究为回顾性研究，使用四川肿瘤医院伦理委员会批准的匿名存档样本。参与者包括经病理证实的I期LUAD患者、年龄匹配的健康供体以及经病理证实的良性肺结节患者。从EDTA抗凝全血中通过低速离心分离富含血小板的血浆，进一步离心获得血小板沉淀。采用尺寸排阻色谱法从血浆中分离外泌体。使用快速RNA提取试剂盒提取总RNA，通过去除rRNA和标准RNA-seq建库进行circRNA测序。使用CIRI软件鉴定circRNA，并通过DESeq2进行差异表达分析。通过qRT-PCR对候选circRNA进行定量验证，使用跨越反向剪接接头的特异性引物。利用四种算法评估候选内参circRNA的稳定性，并计算ROC曲线下面积评估诊断性能。
结果
- 1.
血小板与外泌体circRNA图谱比较：对来自3名LUAD患者和3名健康供体的配对样本进行测序发现，血小板和外泌体中的circRNA长度分布相似，主要集中在100-400个核苷酸，且绝大多数（>95%）为外显子来源。关键发现是，每个血小板样本中检测到的circRNA数量（15,000-20,000个）显著高于每个外泌体样本（约1,000个），高出15-20倍（P = 0.0022）。两组之间在血小板或外泌体中的circRNA丰度无显著差异。
- 2.
血小板circRNA内参基因筛选：基于RNA-seq数据，从高表达且变异系数低的circRNA中筛选出三个候选内参基因：hsa_circ_0124919、hsa_circ_0001380和hsa_circ_0001801。通过ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper四种算法评估，一致确定hsa_circ_0001380是血小板circRNA定量中最稳定的内参基因。
- 3.
血小板差异circRNA的筛选与验证：差异表达分析发现多个在LUAD患者血小板中表达发生变化的circRNA。其中，hsa_circ_0061274是下调最显著的circRNA之一。在初步验证队列（22名HD，28名LUAD）中，qRT-PCR证实hsa_circ_0061274在LUAD患者血小板中表达显著低于健康供体（P = 0.0002）。在扩大验证队列（70名LUAD，30名HD，30名BPN）中，该circRNA在LUAD组的表达也显著低于BPN组（P = 0.0098），并且在I期LUAD亚组中仍显著低于BPN组（P = 0.019）。
- 4.
血小板hsa_circ_0061274的诊断价值：ROC分析显示，hsa_circ_0061274在区分LUAD与HD时，AUC为0.85（95% CI：0.74-0.963），灵敏度85.7%，特异度81.8%。在区分LUAD与BPN时，AUC为0.75（95% CI：0.688-0.939），灵敏度78.6%，特异度77.3%。特别重要的是，在仅包含最大直径<3cm的单发结节的I期LUAD亚组中，区分I期LUAD与BPN的AUC仍达到0.68（95% CI：0.623-0.895），灵敏度50.0%，特异度95.5%。
讨论
本研究证实血小板是比血浆外泌体更丰富、更稳定的circRNA来源。首次确立了血小板hsa_circ_0001380作为血小板circRNA qRT-PCR定量的可靠内参基因，并验证了血小板hsa_circ_0061274作为单分子标志物，能够区分早期LUAD与良性肺结节及健康个体，具有早期诊断和筛查价值。虽然hsa_circ_0061274在胃癌中也有下调报道，提示其可能是一种泛癌现象，但其在LUAD中的具体生物学功能和机制尚不明确。本研究的局限性包括单中心回顾性设计、样本量有限、缺乏前瞻性或多中心验证，且未探讨该circRNA的功能机制，也未与常规肿瘤标志物或其他液体活检标志物（如ctDNA）进行系统比较。未来的研究应整合多组学标志物，并探索血小板circRNA与宿主抗肿瘤免疫反应之间的关联。
结论
本研究首次系统性地提供了血小板circRNA在数量上优于外泌体circRNA的证据，确定了hsa_circ_0001380作为血小板circRNA qRT-PCR的稳健内参基因，并验证了血小板hsa_circ_0061274作为区分肺腺癌与良性肺结节的微创生物标志物。这些发现确立了血小板circRNA在精准肿瘤学临床应用中的潜在价值。
