《Frontiers in Pharmacology》：Indoleamine 2,3-dioxygenase-regulated macrophages metabolic reprogramming rescues tacrolimus-induced nephrotoxicity
编辑推荐：
他克莫司（TAC）是器官移植后的核心免疫抑制剂，但其慢性肾毒性是临床重大挑战。本研究揭示了TAC通过抑制吲哚胺-2,3-双加氧酶1（IDO1），阻断色氨酸代谢途径，导致新（de novo）NAD+合成减少，从而驱动巨噬细胞代谢重编程（脂肪酸β-氧化受损、糖酵解增强），促使其向促炎M1表型极化，加剧肾损伤。有趣的是，外源性补充犬尿氨酸（KYN）或直接激活PPARα增强脂肪酸氧化，可有效逆转这一过程，为防治TAC相关肾损伤提供了新的潜在治疗靶点和策略。
3 Result
3.1 TAC破坏肾脏中的色氨酸代谢
为了研究TAC对肾脏代谢网络的影响，研究人员对对照组（CON）、TAC处理组和TAC+KYN处理组小鼠的肾皮质进行了非靶向代谢组学分析。主成分分析显示三组代谢谱明显分离，表明TAC诱导了肾皮质显著的代谢重塑，而补充KYN可部分恢复代谢谱至对照组水平。火山图分析发现TAC处理后大量代谢物发生显著改变。京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，15条代谢通路受到显著影响，其中色氨酸代谢是受干扰最显著的。层次聚类热图进一步显示，TAC处理组小鼠体内色氨酸水平升高，而其下游代谢物如犬尿氨酸和喹啉酸显著降低，表明色氨酸-犬尿氨酸通路通量受损，新（de novo）NAD+合成可能受到抑制。这些变化表明TAC诱导的肾毒性与色氨酸代谢和肾脏能量平衡失调相关。
3.2 TAC特异性抑制Ido1表达并诱导肾损伤
为探究纠正色氨酸代谢紊乱对TAC肾损伤的潜在保护作用，研究人员设置了CON、TAC和TAC+KYN三组小鼠进行为期8周的处理。与对照组相比，TAC显著降低了尿肌酐水平，增加了尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮和尿酸水平，而联合给予KYN可显著逆转这些改变。组织学分析显示TAC诱导了明显的肾小管损伤，包括小管上皮变性、小管扩张、管腔内蛋白管型形成和炎性细胞浸润，KYN治疗减轻了这些形态学异常并降低了小管损伤评分。
靶向代谢组学分析进一步揭示了TAC在肾皮质中对新（de novo）NAD+合成的特征性抑制模式：TAC显著增加了色氨酸水平，同时显著降低了犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸以及终产物NAD+。犬尿氨酸/色氨酸比值，作为IDO1活性的经典替代指标，也显著降低，表明IDO1活性受到实质性抑制。KYN补充可有效恢复这些代谢物水平。Western印迹和RT-qPCR分析进一步证实TAC显著抑制了肾脏IDO1的表达。分子对接分析也表明TAC可特异性靶向IDO1。这些发现表明TAC与肾皮质IDO1表达下调相关，从而抑制了新（de novo）NAD+的合成。
3.3 IDO1抑制破坏脂肪酸氧化并损害肾脏能量代谢
鉴于IDO1及其相关的新（de novo）NAD+合成在维持细胞能量稳态中的关键作用，研究人员进一步对肾皮质进行了靶向能量代谢组学分析。IDO1抑制显著增加了葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸和丙酮酸的水平，表明有氧糖酵解增强，而KYN补充有效逆转了这些中间产物的积累。在三羧酸循环中，TAC处理导致琥珀酸减少，而这一减少并未被KYN纠正。
在脂肪酸氧化方面，TAC处理导致中长链酰基肉碱和游离脂肪酸显著积累，而短链和超长链脂肪酸无变化。由于中长链脂肪酸需经线粒体β-氧化，其选择性积累表明TAC主要损害了线粒体β-氧化。KYN补充有效减少了这些脂肪酸和酰基肉碱的积累。进一步的细胞实验表明，TAC显著抑制了以葡萄糖或棕榈酸为底物时的氧化磷酸化，表现为基础呼吸和最大呼吸降低，而外源性KYN恢复了这些缺陷。值得注意的是，以棕榈酸为主要底物时最大呼吸的下降更为明显，表明TAC优先损害脂肪酸氧化。对脂肪酸β-氧化相关酶表达的分析显示，TAC处理并未显著改变其mRNA和蛋白水平，提示KYN介导的脂肪酸β-氧化改善不太可能依赖于这些酶的表达调控，而是反映了整体代谢稳态的恢复。
3.4 IDO1抑制通过驱动巨噬细胞代谢重编程诱导肾损伤
为进一步研究IDO1抑制对肾损伤的影响，研究人员设置了CON、TAC和特异性IDO1抑制剂1-MT处理组。生化分析显示，TAC和1-MT处理均导致显著的肾功能障碍。组织学检查显示两组均出现明显的肾小管损伤，表明TAC诱导的肾损伤与直接抑制IDO1的效果一致。
研究人员进一步在肾小管上皮细胞和巨噬细胞中评估了TAC和1-MT的代谢效应。在HEK293T细胞中，TAC和1-MT均未显著改变糖酵解或三羧酸循环中间产物，表明对上皮细胞基础能量代谢影响甚微。相反，在iBMDM巨噬细胞中，出现了糖酵解增强和脂肪酸氧化减少。脂质组学分析显示iBMDM中中长链游离脂肪酸显著积累。KYN补充有效逆转了糖酵解中间产物的积累和游离脂肪酸的堆积。线粒体呼吸分析表明，IDO1抑制显著降低了巨噬细胞的氧消耗速率，且在棕榈酸为底物时下降更显著，同时细胞外酸化率升高。这些发现表明，IDO1抑制主要在巨噬细胞而非肾小管上皮细胞中诱导能量代谢重编程，其特征是脂肪酸β-氧化受损和糖酵解增强，而KYN可部分恢复此代谢失衡。
3.5 脂肪酸氧化缺陷抑制M2极化并促进肾脏炎症
先前研究表明，M1巨噬细胞主要依赖糖酵解供能，而M2巨噬细胞主要依赖脂肪酸氧化和氧化磷酸化。为探究TAC诱导的代谢紊乱是否影响巨噬细胞极化，研究人员通过免疫荧光染色评估了肾组织中M1标志物CD86/CD68和M2标志物ARG1/CD68的表达。结果显示，TAC显著增加了肾脏巨噬细胞总体数量，提高了M1巨噬细胞比例，降低了M2群体。KYN补充有效逆转了这一表型转变。RT-qPCR结果显示，TAC和1-MT均显著上调促炎基因，而下调抗炎基因，KYN处理则使这些失调的转录谱正常化。在原代肾巨噬细胞中也观察到了类似趋势。这些发现表明，IDO1抑制不仅重塑巨噬细胞能量代谢，还驱动其向促炎M1表型转变，并损害抗炎M2表型的维持。
3.6 激活PPARα恢复脂肪酸氧化并预防TAC诱导的肾毒性
PPARα在肾脏高表达，是调节脂肪酸摄取、转运和β-氧化的关键转录因子。为阐明脂肪酸氧化受损在TAC肾毒性中的作用，研究人员使用PPARα特异性激动剂佩马贝特进行干预。体内实验表明，佩马贝特显著改善了TAC诱导的肾功能障碍，并减轻了组织学损伤。代谢组学和脂质组学分析显示，PPARα激活显著逆转了TAC诱导的糖酵解中间产物和中长链游离脂肪酸的积累。然而，靶向色氨酸代谢组学显示，佩马贝特未能挽救TAC诱导的色氨酸代谢改变，IDO1活性也未恢复。线粒体呼吸分析表明，PPARα激活显著增加了TAC处理后肾皮质细胞的基础和最大氧消耗速率，且在棕榈酸驱动的呼吸中改善更为明显。在巨噬细胞中也观察到一致的结果。这些结果表明，即使不补充NAD+，仅恢复脂肪酸β-氧化就足以减轻TAC诱导的肾损伤和巨噬细胞代谢重编程，突出了脂肪酸氧化损伤对TAC相关免疫代谢毒性的主要贡献。
4 Discussion
本研究结合体内外模型，探讨了巨噬细胞在TAC诱导肾毒性机制中的作用。研究发现TAC选择性抑制了色氨酸通路，特别是IDO1介导的色氨酸-犬尿氨酸通路。TAC通过靶向肾脏IDO1活性，减少新（de novo）NAD+合成，从而诱导肾脏代谢重编程，包括中长链脂肪酸和酰基肉碱积累以及糖酵解增强。这伴随着肾脏巨噬细胞浸润，并使其向M1极化转变。外源性补充KYN可逆转新（de novo）NAD+的下降并纠正巨噬细胞极化，从而减轻肾损伤。此外，通过直接激活PPARα来恢复脂肪酸氧化可改善肾脏代谢功能并减轻组织损伤，表明增强脂肪酸氧化可在不依赖色氨酸代谢的情况下提供肾脏保护。体外代谢谱分析表明，巨噬细胞而非肾小管上皮细胞，表现出与体内一致的代谢变化。这些发现表明，TAC通过靶向IDO1诱导巨噬细胞代谢重编程，从而触发其极化转变。综上所述，通过补充新（de novo）NAD+来恢复肾脏巨噬细胞的脂肪酸氧化，可能为TAC诱导的肾损伤提供一种新的治疗策略。
