摩尔多瓦耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因组监测：揭示高毒力高耐药克隆的传入与院内传播

《Frontiers in Microbiology》：Genomic surveillance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in the Republic of Moldova

本研究通过全基因组测序（WGS）对摩尔多瓦2020-2023年间收集的99株疑似产ESBL或碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）进行了系统性分析，揭示了其高度的耐药性、主要的流行克隆（如全球传播的ST395、ST23及地区性优势株ST377）、携带的关键耐药基因（如 blaOXA-48、blaCTX-M-15）和毒力特征，证实了多重耐药（MDR）及高毒力（hvKp）菌株在多家医院间的传播，强调了基因组监测对于指导感染防控和抗生素管理策略的至关重要性。

　　

引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是肠杆菌科的重要成员，也是全球范围内最主要的抗菌药物耐药性（AMR）医院获得性感染病原体之一。临床上，肺炎克雷伯菌主要分为经典（cKp）和高毒力（hvKp）两种类型。hvKp具有更强的侵袭力，且日益与碳青霉烯类抗生素耐药性结合，导致治疗选择极为有限。了解感染的传播源——是患者间传播还是独立事件——对于制定有效的感染控制措施至关重要。本研究旨在利用全基因组测序（WGS）技术，对2020年至2023年间从摩尔多瓦全国收集的99株产ESBL或耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌进行深入的基因组学分析，以阐明其耐药机制、克隆传播和毒力特征。

材料与方法

研究菌株来源于摩尔多瓦国家抗菌药物耐药性流行病学监测系统（SNSE RAM）网络，在2020年1月至2023年12月期间共收集99株疑似产ESBL或耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌分离株。菌株主要来自血液（44.4%）、尿液（52.5%）和脑脊液（3.0%）。抗菌药物敏感性测试遵循EUCAST标准。全基因组测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行。生物信息学分析利用丹麦基因组流行病学中心的服务平台，使用ResFinder鉴定耐药基因，PlasmidFinder检测质粒，MLST 2.0进行多位点序列分型，CSI Phylogeny 1.4构建SNP系统发育树，并利用Kleborate工具评估菌株毒力。

结果

菌株来源：绝大多数（96.96%）分离株来自医院获得性感染，其中35.35%来自成人重症监护室。患者以65岁以上老年人为主。

抗菌药物敏感性：菌株对关键抗生素类别表现出极高的耐药率：第三代头孢菌素（98%）、氟喹诺酮类（97%）、氨基糖苷类（95%）和碳青霉烯类（68%）。在可获得数据的42株菌中，有5株（12%）对粘菌素耐药。

MLST分型：在研究的菌株中鉴定出16种不同的MLST型别。最常见的型别为ST395（N=56）、ST377（N=12）和ST23（N=5）。ST395在大多数医疗机构中均有发现。

系统发育分析：系统发育树显示，相同ST型的菌株遗传相似性更高。研究发现多个几乎相同的菌株簇，表明部分样本间存在流行病学联系。值得注意的是，ST395和ST377分离株出现在多家不同的医院。对56株ST395菌株的进一步分析揭示了两个主要集群，表明可能存在多次独立传入以及医院间的传播。

高毒力肺炎克雷伯菌：使用Kleborate工具，鉴定出多株高毒力肺炎克雷伯菌（HvKp）。共发现37株菌具有高毒力评分（4分），2株菌具有极高毒力评分（5分）。评分5分的两株菌分别属于ST23 K1和ST380 K2克隆谱系。评分4分的菌株包括33株ST395 K39、3株ST23 K57和1株ST25 K39。

耐药基因分析：所有ST395菌株均携带介导碳青霉烯耐药的bla_OXA-48基因，并且绝大多数同时携带bla_CTX-M-15、bla_OXA-1、bla_NDM-1和bla_TEM-1B基因。非ST395菌株的β-内酰胺酶基因存在更多变异。此外，在菌株中还广泛检测到其他耐药基因，如aac(6′)-Ib-cr、多种bla_SHV基因、OqxA/B、sul1、qnrS1等。16S rRNA甲基转移酶基因armA和rmtC（介导对氨基糖苷类的高水平耐药）分别在16株和39株菌中被发现。

质粒分析：大多数分离株携带Col组（如ColRNAI, Col440II, Col156）的质粒/复制子。同时检测到包括IncFIA、IncFIB、IncFII、IncR等在内的多种复制子类型的质粒。值得注意的是，从不同医院和门诊机构分离的5株不同ST型菌株均携带repB质粒，这支持了耐药基因通过质粒在摩尔多瓦的肺炎克雷伯菌种群间水平传播的推测。

讨论

本研究对摩尔多瓦的99株耐药肺炎克雷伯菌进行了基因组学“快照”。系统发育分析显示该国肺炎克雷伯菌具有广泛的多样性，且高度相似的克隆出现在不同医院，表明产ESBL和碳青霉烯酶的菌株存在多次独立传入。

ST395是最常见的型别，且均为高毒力菌株，其携带的bla_OXA-48和bla_CTX-M-15等耐药基因与高毒力特征的共存，印证了流行克隆中耐药性与毒力汇聚的全球趋势。ST377是第二常见的型别，此前主要在中东地区报道，本研究提示其可能在该区域传播。所有ST377菌株均非高毒力，但其高度的耐药性和在多所医院的检出表明存在局部传播链，需引起监测关注。此外，研究还检出了在全球（特别是亚洲和欧洲）广泛流行的高风险克隆，如高毒力的ST23和耐碳青霉烯的ST11。

ST395和ST377菌株在多所医院形成聚集簇，提示存在持续的院内及院间传播，这凸显了在高风险病区加强感染预防控制和实施常规分子监测的迫切性。研究中大量菌株具有高毒力评分，结合其多重耐药特性，预示这些菌株的传播可能带来严重的公共卫生影响。质粒分析结果，尤其是repB质粒在不同无关谱系中的出现，进一步证实了质粒介导的耐药基因跨克隆传播是摩尔多瓦肺炎克雷伯菌耐药性扩散的重要机制。

结论

综上所述，本研究揭示了包括碳青霉烯耐药和高毒力菌株在内的多种肺炎克雷伯菌克隆系（如全球传播的ST395、ST23及地区性ST377）被多次独立引入摩尔多瓦，并在多家医院内传播。这些高风险克隆的传播，强调了在医疗机构内加强感染预防与控制措施的紧迫性。及时的诊断、有效的感染控制以及抗菌药物管理是应对抗菌药物耐药性的关键。支持基于全基因组测序的持续研究和监测，对于及时识别高风险克隆、采取精准的感染控制措施以阻止耐碳青霉烯肠杆菌科细菌在摩尔多瓦的进一步传播至关重要。