《Frontiers in Genetics》：Long non-coding RNA TGFB2-OT1 as a diagnostic biomarker and ceRNA regulator in rheumatoid arthritis
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本研究通过外周血单个核细胞（PBMC）转录组测序，鉴定出在类风湿关节炎（RA）中特异性高表达的长链非编码RNA NR_125715.1 (TGFB2-OT1)。其表达与类风湿因子（RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anti-CCP）呈正相关，在诊断RA时显示出高准确度（AUC = 0.8610）。生物信息学分析提示，其可能通过miR-6756-3p/E2F2轴发挥ceRNA（竞争性内源RNA）作用，并与RNA结合蛋白FUS相互作用，共同参与RA发病。该研究为RA的诊断和机制探索提供了新的潜在靶点。
研究背景与目的
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以持续性滑膜炎和进行性关节破坏为特征的慢性全身性自身免疫病。尽管其全球患病率呈下降趋势，但遗传和环境因素仍被认为是其发病的关键因素。近年来，越来越多的证据强调了非编码RNA调控等表观遗传机制在RA发病和进展中的重要性。其中，长链非编码RNA（Long Non-coding RNA, lncRNA）在自身免疫疾病领域受到越来越多的关注。LncRNA是长度超过200个核苷酸的RNA转录本，定位于细胞核或细胞质，参与DNA合成、转录和翻译的调控，并在细胞凋亡、分化、增殖以及包括炎症和自身免疫病在内的多种疾病发病机制中发挥复杂多样的生物学作用。本研究旨在通过全转录组测序描绘RA患者与健康对照外周血单个核细胞中lncRNA的表达谱，鉴定关键的差异表达lncRNA，并探讨其作为诊断生物标志物和潜在治疗靶点的可能性。
材料与方法
本研究招募了潍坊医学院附属医院风湿免疫科的61名RA患者，以及同期纳入的39名年龄和性别匹配的健康对照、18名系统性红斑狼疮（SLE）患者和20名原发性干燥综合征（pSS）患者。研究方案通过了潍坊医学院附属医院伦理委员会的批准。从参与者采集的静脉血样本通过Ficoll密度梯度离心分离出PBMC。研究人员选取了5名RA患者和5名健康对照的PBMC样本进行全转录组测序。随后，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）在扩大队列（56名RA、18名SLE、20名pSS和39名健康对照）中对候选lncRNA进行验证。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估其诊断效能。利用多种生物信息学工具，如Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析、miRDB、DIANA-miRPath、catRAPID omics、RBPDB、AnnoLnc2、ViennaRNA等，预测了lncRNA潜在的miRNA–mRNA–蛋白相互作用和功能机制。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0软件进行。
结果：差异表达lncRNA的鉴定与筛选
对5名RA患者和5名健康对照的PBMC进行高通量RNA测序，共检测到16,433个独特的lncRNA。根据差异倍数大于2且p值小于0.05的标准，共鉴定出2,162个显著差异表达的lncRNA，其中1,212个上调，950个下调。无监督层次聚类分析显示，根据lncRNA表达特征，RA样本与健康对照样本可以明显区分。基于其基因组来源，差异表达的lncRNA被分为基因间区、外显子、内含子和未注释类别。同时，鉴定出895个差异表达的mRNA。通过严格的筛选标准，研究人员选择了6个差异显著的lncRNA（3个上调，3个下调）进行后续实验验证。qRT-PCR结果显示，所有6个候选lncRNA的表达趋势均与测序数据一致，但其中仅ENST00000413791和NR_125715.1（TGFB2-OT1）表现出统计学上的显著差异。
NR_125715.1作为RA的潜在新型诊断生物标志物
在包含56名RA患者、18名SLE患者和20名pSS患者的扩大队列中，研究人员进一步评估了ENST00000413791和NR_125715.1的诊断潜力。结果表明，两种lncRNA在RA患者的PBMC中仍显著失调。在该扩大队列中，ROC曲线分析显示，ENST00000413791的AUC为0.8304，而NR_125715.1的AUC达到0.8610，显示出更高的诊断准确度。特异性分析显示，与健康对照相比，ENST00000413791在pSS中无显著变化，而NR_125715.1在pSS和SLE中均无显著差异，支持其在RA中的特异性失调。相关性分析显示，NR_125715.1表达水平与抗CCP抗体滴度（r = 0.3809, p = 0.0041）和类风湿因子（r = 0.297, p = 0.036）呈正相关，但与血沉、C反应蛋白或DAS28评分无显著相关性。这些结果支持NR_125715.1作为一种基于PBMC的RA分类诊断候选生物标志物，但其预后价值、纵向监测或治疗反应效用尚未在本横断面研究中确立。
NR_125715.1在RA发病中的潜在作用机制
研究人员随后对NR_125715.1在RA中的潜在功能机制进行了探究。首先，假设其可能作为竞争性内源RNA发挥作用。利用miRDB数据库，预测出15个与NR_125715.1有高结合潜力的microRNA（靶标得分大于85）。功能富集分析表明，这些miRNA参与基因表达调控、核酸结合转录因子活性和蛋白质修饰等92个GO生物过程，并富集于Hippo、FoxO、Wnt、MAPK、Ras和PI3K–Akt等39条信号通路，这些通路均已知与RA发病相关。通过整合多个数据库预测这些miRNA的靶标mRNA，并构建了一个全面的NR_125715.1–miRNA–mRNA ceRNA网络。对RNA-seq数据的独立分析显示，有154个mRNA与NR_125715.1表达显著相关。通过交集分析，转录因子E2F2成为一个特别有前景的靶基因，qRT-PCR验证证实E2F2在RA患者PBMC中的表达相对于健康对照显著上调。这提示NR_125715.1可能通过吸附如miR-6756-3p等miRNA，作为ceRNA发挥作用，从而上调E2F2的表达，参与RA相关的炎症过程。
此外，研究人员还通过计算预测探索了NR_125715.1的蛋白质结合潜力。使用catRAPID omics v2.0平台预测了51个潜在的相互作用蛋白，置信度得分阈值超过2.4。对这些蛋白的Metascape富集分析显示，它们显著富集于与mRNA代谢、RNA稳定性调节以及miRNA介导的基因沉默的正向调控相关的生物过程。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步表明NR_125715.1参与mRNA代谢调节和RNA剪接过程。通过整合来自RBPDB、AnnoLnc2等多个数据库的预测数据，发现RNA结合蛋白FUS（P35637）是一个高置信度的相互作用蛋白。利用Cistrome DB数据库，进一步鉴定出ZNF143、POLR2A和FLI1是调控FUS表达的关键转录因子。RNA二级结构预测显示，NR_125715.1形成了稳定的茎环结构，这可能有助于其与FUS等结合蛋白的相互作用。
研究人员还探讨了NR_125715.1潜在的化学修饰。使用SRAMP在线工具预测潜在的m6A甲基化位点，并使用Emboss CpGPlot和MethPrimer检测CpG岛。根据这些分析，在NR_125715.1序列中未检测到m6A甲基化位点或CpG岛。
讨论
本研究证实了NR_125715.1在RA患者PBMC中特异性高表达，并与关键的自身抗体（RF、抗CCP）水平相关，展现出作为RA诊断生物标志物的潜力，尤其当标准血清学检测呈阴性或模棱两可时。与先前报道的lncRNA（如PICSAR、GAS5、NEAT1、IFNG-AS1）相比，NR_125715.1在RA中表现出较高的疾病特异性。
在机制层面，生物信息学分析提示NR_125715.1可能通过双重机制参与RA发病。一方面，它可能作为ceRNA，通过吸附miR-6756-3p来解除对下游靶基因E2F2的抑制，而E2F2已知在RA滑膜组织中过表达，并通过调节代谢、应激反应和核糖体合成等过程参与RA滑膜成纤维细胞的发病机制。另一方面，NR_125715.1可能通过与RNA结合蛋白FUS直接相互作用，影响mRNA代谢、RNA稳定性和炎症信号通路（如IL-6/STAT3通路）。这些相互作用可能共同促进了RA中的免疫失调和炎症反应。
然而，本研究也存在一些局限性。RNA-seq发现队列的样本量较小（5名RA对比5名健康对照），且机制推断（ceRNA和蛋白质结合预测）是基于生物信息学分析的假设，需要通过荧光素酶报告基因实验、扰动-挽救实验以及RNA结合蛋白免疫沉淀等实验进行功能验证。未来需要多中心、前瞻性的大队列研究，并结合滑膜等组织水平的验证，来确立其临床应用价值和生物学普适性。
结论与未来方向
本研究发现并验证了lncRNA NR_125715.1（TGFB2-OT1）是RA患者PBMC中一个新型的、疾病特异性表达的潜在诊断生物标志物。其表达与抗CCP抗体和类风湿因子呈正相关。生物信息学分析表明，NR_125715.1可能通过miR-6756-3p/E2F2轴发挥ceRNA功能，并与RNA结合蛋白FUS相互作用，在RA的免疫失调中扮演关键调节角色。这些发现扩展了对lncRNA介导的RA调控机制的理解，并为开发基于lncRNA的诊断生物标志物和自身免疫疾病的精准治疗策略奠定了基础。
