《Frontiers in Oncology》：DEPDC7 as a potential tumor suppressor in hepatocellular carcinoma: preliminary evidence for targeting the JAK1/STAT3 axis
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本文系统性地揭示了肝细胞癌（HCC）中一个肝脏富集基因——DEPDC7的抑癌功能与分子机制。研究发现，DEPDC7在肝癌中表达显著下调，其过表达可抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。深入的机制探索表明，DEPDC7通过直接结合并抑制JAK1/STAT3信号通路，进而阻滞细胞周期、诱导凋亡并抑制上皮-间质转化（EMT）。本研究首次阐明了DEPDC7靶向JAK1/STAT3轴的抑癌作用，为肝细胞癌的诊疗提供了新的潜在靶点与理论基础。
3.1 DEPDC7在肝细胞癌中的临床相关性及数据挖掘
为了探究DEPDC7在肝细胞癌（HCC）中的临床相关性，研究首先利用TCGA数据库分析了其在泛癌中的表达谱。分析显示，与正常肝组织相比，DEPDC7的mRNA表达在肝细胞癌中显著下调，提示其在肝癌中可能扮演抑癌角色。进一步利用Kaplan-Meier生存分析评估了DEPDC7表达对HCC患者预后的意义，结果表明高表达的DEPDC7与更佳的总生存期、无进展生存期和疾病特异性生存期显著相关，支持了其保护性作用。值得注意的是，在接受索拉非尼治疗的患者中，应答者的DEPDC7表达水平似乎高于无应答者，尽管这一趋势的统计学显著性（P=0.061）仍需更大样本验证。此外，在多种HCC细胞系中检测发现DEPDC7普遍呈低表达，这与TCGA数据一致。总之，这些结果共同表明，DEPDC7在HCC中频繁下调，其高表达与良好的预后和潜在的治疗应答增强相关，凸显了其作为预后生物标志物和治疗靶点的潜力。
3.2 DEPDC7理化性质与结构特征的生物信息学分析
为了阐明DEPDC7的分子特性，研究人员进行了全面的生物信息学分析。全长DEPDC7蛋白由511个氨基酸组成，预测分子量为58.3 kDa。DeepTMHMM预测表明其无信号肽，等电点为7.62，是一种非分泌性亲水蛋白。其不稳定性指数为40.59，提示在生理条件下可能不稳定。生物信息学分析鉴定出DEPDC7在其N端区域含有一个保守的DEP结构域。通过SOPMA方法和AlphaFold3建模进行的二级和三级结构预测显示，该蛋白具有较高的α螺旋含量，其预测的三维结构显示DEP结构域由三个α螺旋和三个β折叠形成一个紧凑的核心。对翻译后修饰位点的预测分析发现，DEPDC7存在多个潜在的修饰位点，包括磷酸化和泛素化，其中四个酪氨酸磷酸化位点（Y84, Y248, Y449, Y451）被识别，Y84位于DEP结构域内。此外，DNA甲基化分析预测在DEPDC7基因位点的腺嘌呤1283处存在一个高置信度的甲基化位点。这些结构特征为理解DEPDC7在HCC发病机制中的潜在功能机制和调控模式提供了重要线索。
3.3 DEPDC7在肝细胞癌细胞中的功能表征
前期的生物信息学分析显示DEPDC7在HCC组织中下调并与良好预后相关。为了在细胞水平研究其功能，研究人员以HCC细胞系Huh-7为模型。首先利用DeepLoc算法预测了DEPDC7的亚细胞定位，结果显示其主要定位于细胞质和质膜。通过免疫荧光染色在Huh-7细胞中进行实验观察，其分布模式提示DEPDC7同时存在于细胞质和细胞核中。为了研究DEPDC7在HCC中的功能作用，研究构建了DEPDC7过表达的慢病毒载体并感染Huh-7细胞。qPCR和蛋白质印迹分析证实，与阴性对照组相比，DEPDC7在mRNA和蛋白水平均实现了稳健的过表达。鉴于之前有报道称敲低DEPDC7可促进HCC细胞增殖，研究人员接下来评估了DEPDC7过表达对Huh-7细胞生长的影响。CCK-8实验显示，DEPDC7过表达细胞的吸光度值显著低于对照组，表明细胞增殖受到抑制。这一表征证实，DEPDC7不仅在HCC细胞中转录沉默，而且表现出独特的亚细胞分布模式，其过表达能够抑制HCC细胞的增殖能力。
3.4 转录组图谱揭示DEPDC7介导的JAK1/STAT3信号抑制
为了阐明DEPDC7在肝细胞癌中发挥抑癌功能的分子机制，研究对转染了阴性对照和DEPDC7过表达载体的Huh-7细胞进行了RNA测序分析。差异表达分析显示，与对照组相比，DEPDC7过表达组中有1601个基因上调和274个基因下调。随后对差异表达基因进行基因本体富集分析，结果显示，在生物过程类别中，DEPDC7可能通过调节细胞周期、促进凋亡和自噬、增强炎症反应以及调节细胞粘附相关通路来抑制细胞增殖。此外，对HALLMARK基因集的富集分析进一步揭示了p53和凋亡通路的显著激活，以及增殖和致癌信号通路的抑制。值得注意的是，JAK1/STAT3信号通路受到显著影响，表明DEPDC7可能通过该通路在肿瘤微环境中促进炎症反应。实验验证表明，DEPDC7过表达上调了促凋亡基因的mRNA水平，同时下调了抗凋亡基因（如BCL-2、BCL-XL和Survivin）的表达。同时，DEPDC7过表达也改变了细胞周期相关基因（如p21、p16和c-MYC）的表达，从而通过诱导细胞周期阻滞抑制Huh-7细胞的增殖。为了功能上验证这些基因表达变化，研究通过流式细胞术进行了Annexin V/PI染色。与qPCR结果一致，与对照组相比，DEPDC7过表达显著增加了凋亡细胞（早期和晚期凋亡）的百分比。这些分析确立了DEPDC7通过同时激活p21/p16介导的细胞周期阻滞、抑制c-MYC表达、调节BCL-2家族蛋白以促进凋亡，以及抑制JAK1/STAT3信号以重塑肿瘤微环境，从而协同调节抑癌机制。
3.5 DEPDC7通过直接结合其SH2和假激酶结构域靶向JAK1
鉴于JAK1/STAT3信号通路在促进肿瘤细胞存活和增殖中的明确作用，研究评估了DEPDC7对该通路的调节。qPCR分析显示，与阴性对照组相比，DEPDC7过表达细胞中JAK1和STAT3的mRNA水平降低。与这些发现一致，蛋白质印迹分析表明DEPDC7过表达导致JAK1蛋白表达下降。此外，DEPDC7过表达可能通过抑制JAK1/STAT3通路抑制c-MYC的转录激活，导致抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL的下调以及p21的上调，从而阻碍细胞周期进程和增殖。为了研究DEPDC7是否与JAK1直接相互作用，研究使用AlphaFold3方法对DEPDC7和JAK1进行了计算对接。结构建模揭示了界面处存在13个氢键，其中包括涉及DEPDC7残基D250、S285、R58和K114的四个强相互作用。PDBePISA分析估计DEPDC7–JAK1复合物的结合能为-12.2 kcal/mol，表明存在稳定的相互作用。有趣的是，有研究表明DEPDC7与JAK1的SH2和假激酶结构域结合，可能抑制其二聚化，从而损害其信号转导和正常生物学活性。随后的免疫共沉淀实验提示DEPDC7和JAK1在Huh-7细胞中存在内源性的物理相互作用，支持了直接的调节机制。蛋白质-蛋白质对接预测DEPDC7与JAK1的SH2和假激酶结构域相互作用，这些区域对JAK1同源二聚化和调节至关重要。这一预测，结合免疫共沉淀数据，提出了一个模型：DEPDC7的结合可能空间阻碍JAK1二聚化或变构调节其活性，从而导致观察到的JAK1/STAT3信号下调。这些发现将DEPDC7定位为HCC中JAK1/STAT3信号的新型内源性调节因子，通过转录和翻译后机制相结合来限制肿瘤进展。
3.6 DEPDC7过表达抑制Huh-7细胞的侵袭和上皮-间质转化
此前的转录组分析显示，DEPDC7过表达的Huh-7细胞中上皮-间质转化相关通路受到显著调节，表明DEPDC7可能在调节细胞运动和侵袭性中发挥作用。为了进一步探索DEPDC7的分子相互作用组，研究进行了免疫共沉淀结合质谱分析。对DEPDC7相互作用蛋白的KEGG通路富集分析显示，在细胞连接相关通路中存在显著富集，包括粘着连接、间隙连接和紧密连接信号，这支持了DEPDC7与EMT调节之间的功能联系。Transwell迁移和侵袭实验表明，与对照细胞相比，DEPDC7过表达的Huh-7细胞的迁移和侵袭能力显著降低。同时，研究还进行了伤口愈合实验，与上述侵袭表型一致，DEPDC7过表达显著延迟了伤口闭合。为了评估DEPDC7对EMT进程的影响，研究通过蛋白质印迹检测了关键EMT标志物的表达水平。DEPDC7过表达细胞显示出上皮标志物E-钙黏蛋白的表达增加，以及间质标志物N-钙黏蛋白和Vimentin的表达减少，表明EMT程序受到抑制。此外，扫描电子显微镜观察揭示了DEPDC7过表达细胞中与EMT抑制相关的形态学变化。这些细胞表现出更少、更短的微绒毛，残留结构集中在膜突起周围。丝状伪足数量也减少且结构紊乱。这些数据共同表明，DEPDC7至少部分通过抑制EMT来抑制HCC细胞的增殖和侵袭。
