《Frontiers in Immunology》：Dual role of icaritin in attenuating allograft rejection and exerting antitumor effects in mice
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本文综述聚焦于移植后长期免疫抑制导致恶性肿瘤风险增高这一临床困境，探索了兼具抗肿瘤活性的新型免疫抑制剂。研究发现，临床抗肝癌药物淫羊藿苷（ICT）在小鼠心脏移植模型中，能通过靶向转录因子CEBPB，抑制其下游靶点PIM1的表达，进而有效抑制CD4+T细胞的活化、增殖及向Th1亚群的分化，从而减轻同种异体移植物排斥反应。尤为重要的是，在荷瘤（HCC）心脏移植模型中，ICT与经典免疫抑制剂他克莫司（FK506）联用，不仅能协同延长移植物存活，还能显著降低肿瘤负荷。该研究为开发用于器官移植（尤其是肝细胞癌肝移植）的、兼具抗排斥与抗肿瘤活性的新型免疫治疗方案提供了重要的临床前证据。
器官移植是终末期器官疾病的最佳治疗手段，然而，长期使用免疫抑制剂（如钙调神经磷酸酶抑制剂）在抑制排斥反应的同时，会显著增加受者罹患恶性肿瘤的风险，其中恶性肿瘤已成为移植受者第二大死因。因此，探索兼具抗肿瘤活性的免疫抑制剂具有重大意义。雷帕霉素（RAPA）是已知的具有抗肿瘤特性的免疫抑制剂，但其早期使用与肝动脉血栓形成和伤口愈合受损等风险相关。淫羊藿苷（ICT）是一种从淫羊藿中提取的黄酮类化合物，已被中国国家药品监督管理局批准用于治疗不可切除的肝细胞癌（HCC），其临床安全性和有效性已得到证实。既往研究显示ICT具有免疫调节特性，可缓解多种自身免疫性疾病，但其是否能减轻同种异体移植排斥反应尚不明确。
为评估ICT在减轻急性同种异体移植排斥反应中的治疗效果，研究建立了完全主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的异位心脏移植模型（BALB/c供体至C57BL/6J受体）。结果显示，ICT治疗（40 mg/kg/d和70 mg/kg/d）能显著延长心脏移植物存活时间，并减轻移植物的组织病理学损伤和排斥评分。免疫组化染色表明，ICT处理减少了移植物内CD4+和CD8+T细胞的浸润。同时，ICT治疗组受鼠的脾脏重量和脾脏指数显著降低，提示ICT可抑制同种抗原驱动的脾细胞增殖。这些发现综合表明，ICT能有效减轻移植后的同种异体移植排斥反应。
为探索ICT对免疫细胞的调节机制，研究对受鼠脾脏细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。基因本体（GO）分析显示，ICT下调的差异表达基因（ICT-DEGs）富集于辅助性T细胞1（Th1）游出、炎症反应、T细胞活化调控等通路，提示ICT可能通过抑制T细胞的活化、增殖和迁移来减轻排斥反应。对T细胞的深入分析发现，同种移植后，Th1细胞比例显著增加，而ICT治疗可逆转这一趋势。进一步分析CD4+T细胞亚群发现，同种移植上调了Th1细胞相关基因（如、）和共刺激相关基因（如、）的表达，而ICT处理可逆转等基因的表达变化。基因集富集分析（GSEA）表明，同种移植组中Th1/Th2分化、Th17分化、细胞分裂及T细胞受体信号通路等均被上调，而ICT处理则能下调这些通路。
流式细胞术验证结果与测序分析一致：ICT显著降低了受鼠脾脏中总细胞数和CD3+T细胞（尤其是CD4+T细胞）的数量，并特异性降低了CD4+IFN-γ+Th1细胞和CD4+IL-17a+Th17细胞的比例，但对Th2细胞和调节性T细胞（Treg）比例无显著影响。同时，ICT处理组血清中Th1细胞特征性细胞因子IFN-γ的水平也显著降低。这些结果表明，ICT在体内可抑制CD4+T细胞向Th1亚群的分化。
体外实验进一步证实了ICT对CD4+T细胞的直接作用。ICT能以剂量依赖的方式抑制混合淋巴细胞反应（MLR），并抑制CD4+T细胞的早期活化标志CD154和晚期活化标志CD25的表达。CFSE增殖实验表明，ICT可剂量依赖性地抑制CD4+T细胞的增殖。在Th1极化条件下，ICT能显著抑制CD4+T细胞向产生IFN-γ的Th1细胞分化，并降低其关键转录因子T-bet的表达。综上，ICT可直接抑制CD4+T细胞的活化、增殖和Th1细胞分化。
为阐明ICT的作用靶点，研究结合网络药理学数据库预测和单细胞测序的“救援性”差异表达基因（Rescue-DEGs）分析，将丝氨酸/苏氨酸激酶PIM1鉴定为ICT的关键潜在靶点。既往研究表明，PIM1对于CD4+T细胞的活化、增殖和Th1分化是必需的。体外实验证实，ICT处理可显著降低CD4+T细胞中PIM1的mRNA和蛋白表达水平。
进一步机制探究发现，转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β（CEBPB）可结合PIM1启动子并驱动其转录。分子对接和分子动力学模拟表明，ICT能与CEBPB蛋白强效结合，结合自由能为-8.6 kcal/mol，且复合物在分子动力学模拟中表现出高稳定性。细胞热位移分析（CETSA）证实，ICT能与CEBPB直接结合，抑制其热诱导降解。此外，使用CEBPB的高选择性抑制剂Withaferin A处理，能以剂量依赖的方式抑制Th1细胞分化，这进一步支持了靶向CEBPB可抑制Th1分化的结论。以上结果表明，ICT通过直接结合转录因子CEBPB，抑制其下游靶点PIM1的表达，进而抑制CD4+T细胞的Th1分化。
最后，研究在肝细胞癌（Hep1-6细胞）荷瘤小鼠心脏移植模型中，评估了ICT的单药及联合用药效果。实验分组为：同种移植对照组（ALLO）、ICT单药组、他克莫司（FK506）单药组及ICT+FK506联合组。组织病理学显示，ICT与FK506联用表现出协同的免疫抑制效果，能最大程度地减轻急性移植物排斥反应，降低排斥评分和脾脏指数。更重要的是，ICT单药组及联合治疗组的肿瘤负荷显著低于FK506单药组。生存分析显示，ICT与FK506联合治疗能最大程度地延长心脏移植物存活时间。这证明了ICT在联合治疗方案中，能同时发挥抗排斥和抗肿瘤的双重功效。
综上所述，本研究表明，临床抗肝癌药物淫羊藿苷（ICT）可通过靶向CEBPB/PIM1信号轴，抑制CD4+T细胞的活化、增殖及Th1分化，从而减轻同种异体心脏移植的急性排斥反应。在荷瘤移植模型中，ICT与他克莫司联用可协同增强免疫抑制效果、延长移植物存活并降低肿瘤负荷。该研究揭示了ICT作为一种兼具免疫抑制和抗肿瘤活性的候选药物，在器官移植（特别是肝细胞癌肝移植）临床应用中的潜力，为应对移植后排斥与恶性肿瘤风险并存的临床挑战提供了新的策略思路。
