《Frontiers in Behavioral Neuroscience》：Investigating effects of acute severe hypoxia and p38 MAPK inhibition on boldness and anxiety-like behavior in zebrafish larvae
编辑推荐：
本研究发现，斑马鱼幼体在经历足以引发心肌损伤的急性重度缺氧（HE）后，其探索新奇物体（Neophilia， 即大胆行为的体现）的倾向会显著但适度地减弱。有趣的是，在缺氧暴露后给予p38 MAPK抑制剂（p38i）能显著促进幼体生长，但同时也会增加其贴近池壁的时间（Thigmotaxis， 即焦虑样行为的表现）。该研究强调了在评估缺氧暴露损伤（尤其是心脏损伤）的后果时，将行为学终点与生存、生长等指标相结合的重要性，并揭示靶向p38 MAPK通路在促进组织恢复的同时，可能伴随神经行为方面的权衡效应。
1 引言
脊椎动物的心脏和大脑是极高耗能的器官，依赖充足的氧气供应以产生维持代谢过程所需的ATP。当脑血流减少时，神经元活动与底物输送之间的紧密耦联会遭到破坏，这通常由心功能障碍等多种原因引发。在斑马鱼幼体中实施的急性重度全身性缺氧暴露，类似于心肌梗死，会导致包括大脑和心脏在内的多个器官发生氧化损伤。心肌梗死后引发神经后果的心血管参数远不止简单的“泵衰竭”，还包括血压动态变化、炎症信号、屏障功能和脑血管调节等，在评估和治疗有神经并发症风险的心脏病患者时，必须考虑到所有这些因素。
本研究聚焦于斑马鱼幼体，旨在探究在一个关键发育窗口期（此时心脏和神经系统正在积极成熟）发生的急性缺氧损伤是否会建立持久的行为表型。早期暴露模型对于理解成人疾病和行为障碍的发育起源尤为重要。心脏功能与脑功能之间复杂关系中一个未被充分探索的影响是行为的微妙变化。心肌梗死长期以来被认为是一种可诱发行为改变的病症，例如在人类中引发心理应激和行为障碍，并在实验模型中减少探索行为。其主要效应因子很可能是心功能障碍导致的严重组织缺氧。然而，从临床角度，我们对于导致组织缺氧的心血管疾病患者“大胆行为”的具体情况知之甚少。
焦虑样行为和大胆行为是动物个性和情感功能中两个密切相关但不同的维度。焦虑以高度谨慎、回避和对感知到的威胁产生更强的应激反应为特征。大胆行为则反映了个体承担风险和探索新环境的倾向。大胆行为（及其对应面，羞怯）被纳入一个包含16个人格因素的框架中，并与动物行为中的探索行为相关。我们采用新奇物体趋近测试来测量“新事物好奇”，该测试已在14-21日龄（dpf）斑马鱼幼体中得到验证，用于测量新事物好奇，并在14 dpf时观察到最大反应。新事物好奇——即对新奇物体的吸引——是鱼类行为中公认的大胆行为代理指标，反映了冒险倾向和探索驱力。趋触性（贴壁行为）被验证为从7 dpf开始的斑马鱼幼体的焦虑样行为测量指标。这些行为结构在脊椎动物中具有进化保守性，便于向哺乳动物系统转化。
我们的主要目的是探索急性全身性组织缺氧与斑马鱼幼体后续慢性行为效应之间的联系。我们使用心脏骤停和相关的心肌损伤作为缺氧诱导的全身性损伤的代理指标——本质上，模拟人类心肌梗死的影响，而非慢性心脏病。我们在斑马鱼幼体模型中检验了以下假设：急性全身性组织缺氧将导致幼体在继续生长发育过程中出现后续的慢性行为改变。我们还测试了p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）对缺氧相关行为改变的影响。p38 MAPK参与多个身体系统，主要响应应激和炎症，在心血管、神经、免疫、肝脏、胃肠道和生殖系统中发挥重要作用。这种蛋白激酶已被提议作为诱导心脏再生的治疗靶点，它是一种应激反应激酶，调节心脏炎症、细胞死亡、肥厚和收缩力。然而，目前仍无临床证据支持其作为任何炎症性疾病的治疗方法。此外，尚无研究涉及蛋白激酶的心肌恢复加行为评估（作为潜在副作用的一部分）。基于我们先前的实验，在经历心肌缺氧损伤的幼体中，p38 MAPK抑制后心脏功能有所增强，我们分析了该化合物在足以引起心脏损伤和骤停的全身性组织缺氧后对幼体的行为效应。我们检验了p38抑制将改变斑马鱼幼体因缺氧损伤产生的行为变化（焦虑样和大胆样行为）的假设。
斑马鱼作为一个模型，提供了一个易于操作的体内系统来联合评估重度缺氧对行为的影响。通过在缺氧暴露后1周和2周量化趋触性、出室潜伏期、游动速度、探索行为和新奇物体趋近，我们的研究试图将急性重度组织缺氧、心脏损伤、药理恢复和行为效应关联到一个综合框架中，为机制、副作用谱和潜在的预后标志物提供信息。
2 材料与方法
2.1 斑马鱼来源、饲养与繁殖
成年野生型（AB品系）斑马鱼购自德克萨斯州丹顿市的商业供应商。所有成鱼在相同受控条件下饲养。健康的成年斑马鱼（4-6月龄）用作北德克萨斯大学水生设施中的繁殖亲本。
斑马鱼通常在实验室灯光开启时（08:00）繁殖。在计划繁殖的前一晚，将装有作为丰容物的塑料植物的繁殖小缸附着在大鱼缸内壁放置。繁殖时，成年鱼游到繁殖缸上方。因此，作为多对亲鱼繁殖的结果，大量受精卵落入繁殖缸底部并被收集和清洗。
可存活胚胎与未受精卵分离，并在E3培养基中培育。所有存活的胚胎在约4 dpf孵化。幼体每天喂食两次Otohime? A1开口饵料，在14 dpf后与A2交替投喂。幼体始终保持在大致相同的密度下饲养，以避免拥挤导致的生长差异。它们在静水中饲养，每天换水两次。
所有实验均在北德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会许可#18005下进行。
2.2 缺氧和p38 MAPK抑制剂暴露
在7 dpf时将斑马鱼幼体分为三组。第一组为对照组，饲养在常氧鱼缸水中，从未暴露于缺氧或p38 MAPK抑制剂处理。第二组暴露于急性重度环境缺氧（约1 kPa）约20分钟。这段时间被判定为足以诱发至少心肌缺氧损伤。我们的初步实验和先前发表的研究表明，斑马鱼幼体在重度缺氧暴露约20分钟后经历心脏骤停。这种急性重度缺氧暴露不仅导致心脏骤停，还引起心肌细胞凋亡。其他组织，包括大脑和其他神经组织，也很可能因这种程度的全身性缺氧而受损。在当前实验中，来自同一窝的大约100条幼体被置于约1 KPa氧气下暴露约20分钟。暴露后，将幼体放回常氧水中。该组不接受p38 MAPK抑制剂处理。
第三组斑马鱼幼体暴露于上述相同条件的急性重度缺氧。然而，该组在急性重度缺氧暴露后的前12小时内，其周围介质（E3或鱼缸水，取决于日龄）中还暴露于0.3 μmol的p38 MAPK抑制剂（阿斯利康化合物AZ3）。选择该剂量是因为其他实验显示此剂量在缺氧暴露幼体中诱导了最高的心脏功能恢复。暴露于含有p38 MAPK抑制剂的E3培养基12小时后，处理过的幼体被转移到鱼缸水中，直至测试日。
2.3 缺氧暴露后至行为测试前的饲养条件
急性重度缺氧暴露导致心脏骤停和推定心肌缺氧损伤后，所有幼体立即放回常氧E3培养基中饲养，直至8 dpf，此时它们被转移到鱼缸水中。所有幼体每天喂食A1开口饵料两次；达到14 dpf后，与A2交替投喂。行为测试日不喂食。
2.4 生存率评估
在14天期间每天评估生存率，从第7天缺氧暴露前开始，直到第21天行为测试的最后一天。这些缺氧暴露后天数（dHE）相当于发育后天数（dpf）如下：1 dHE = 7 dpf（缺氧暴露后1周），15 dHE = 21 dpf（缺氧暴露后2周）。
2.5 形态计量学变量
行为测试结束后，立即用Z-Fix固定幼体。固定后，按照标准化程序测定体重。使用分析天平测定体重。记录体重后，评估幼体全长。用于测定体长的照片通过连接高分辨率相机的显微镜获取，并在ImageJ中分析。
评估体重和全长后，使用Fulton氏状态因子公式评估幼体生长：K= 100 (W/L3)，其中“W”代表体重，“L”代表全长。
2.6 行为测试：焦虑样和大胆样行为
斑马鱼幼体在两个不同时间点进行评估，以评估焦虑样行为和大胆样行为。行为测试在14-15 dpf（缺氧暴露后1周）和21-22 dpf（缺氧暴露后2周）进行，以评估这两个不同发育点暴露幼体与对照幼体之间的差异。不同组的实验使用不同的幼体，即没有重复测量。
行为测试区域与先前研究使用的相同，由暗启动室和亮启动室组成，两者连接到一个丙烯酸竞技场（14 cm 长 × 6 cm 宽 × 2 cm 深）。整个装置注水深约1.8 cm，水温维持在28 ± 0.5°C。一个高速摄像机位于竞技场上方约30 cm处，记录幼体行为视频。不透明纸板策略性地覆盖记录点周围，以避免任何视觉影响。
为测试焦虑样和大胆样行为，将单个幼体放入暗启动室。在暗启动室适应3分钟后，小心移除分隔的不透明屏障，使幼体可以游入相连的亮启动室。在随后的3分钟内，允许单个幼体在亮启动室适应，然后小心移除分隔亮启动室和测试区域的第二道屏障，开始新奇物体趋近测试。
新奇物体趋近测试用于测量“新事物好奇”，即面对新经历和新环境的意愿。在鱼类中，这是公认的大胆行为代理指标，在14-21 dpf的幼体阶段得到验证。通过测定测试区域内停留在新奇物体附近的时间来量化新事物好奇，从而评估大胆行为。因此，停留在新奇物体附近的时间越长，表示新事物好奇程度越高。新奇物体是一个三维多色物体，由1 cm x 1 cm的蓝色、黄色、绿色和红色乐高“点”组装而成。使用多种颜色是为了避免与斑马鱼颜色偏好相关的偏差。多色乐高 figurines 可用于检查鱼类行为，因为它们作为有效、易于获取和标准化的新奇物体，用于测试鱼类如何响应环境中的陌生物品。
视频录制在第二道门移除时开始。视频录制持续10分钟。个体幼体出现后，立即封闭启动室。在10分钟测试期间未出现的幼体从行为分析中剔除。
所有行为测试仅使用“初次”幼体，即没有幼体被实验两次。
2.7 行为视频分析
使用配备DanoVision扩展的EthoVision XT Noldus软件分析斑马鱼幼体行为的视频记录。在EthoVision中添加同心圆，根据新奇物体的位置将竞技场视频虚拟划分为四个不同的区域。添加的第一个区域是区域3（围绕新奇物体），随后的区域依次以2倍和3倍的放大因子创建区域2和区域1。在新水族箱中的探索行为也用于测量大胆-探索行为。
量化停留在趋触性区域（竞技场墙壁）的时间长度（秒），以评估焦虑样行为。比较从启动室出现的时间、停留在新奇物体区域的时间以及到物体的平均距离，作为斑马鱼幼体大胆行为的代理指标。与运动相关的平均游动速度也被量化。
2.8 统计学
生存分析使用Kaplan-Meier生存分析：LogRank检验。生成一般线性模型（GLM）用于评估在每个区域（趋触性区域、区域1-3，从外到内）停留的时间，以及到物体的平均距离。出现时间用作每个区域停留时间和到新奇物体距离的协变量。用Shapiro Wilk检验评估每个模型的正态性。对非正态分布的数据模型进行秩转换。为此模型生成双向方差分析（ANOVA）。进行Tukey事后检验以找出组间和急性重度缺氧暴露后不同时间点之间的差异。当协变量在双向方差分析中显著时，结果报告为估计边际均值（EMMs）± 标准误（S.E.M.）。如果协变量对特定因变量不显著，则结果绘制为均值 ± 标准误（S. E. M.）。生存分析使用SigmaPlot软件进行。使用R-Studio对Fulton氏状态因子、从启动室出现的时间和速度进行双向方差分析，并对每个区域停留时间和到物体的平均距离进行以出现时间为协变量的双向方差分析。
所有检验的显著性水平设为p< 0.05。实验的逻辑流程见图3 。
3 结果
3.1 生存率
对照组、经历组织缺氧损伤（从心肌损伤明显可见）的种群以及缺氧暴露 + p38 MAPK抑制种群的生存率根据急性重度缺氧暴露后的时间确定。缺氧暴露在暴露后第一天导致HE组生存率为56%，HE + p38 MAPK抑制组为60%。急性重度缺氧暴露两周后，对照组的生存率最高（38%），其次是HE组（16%），最后是HE + p38 MAPK抑制组（11%）。所有成对多重比较程序显示所有组间交互作用（对照组 vs. HE， 对照组 vs. HE + p38 MAPK抑制， 以及 HE vs. HE + p38 MAPK抑制）均存在显著差异（P= < 0.001）。
3.2 急性重度缺氧暴露对生长的影响
在HE后1周，所有三组之间的体重无显著差异（P> 0.05）。然而，HE后2周所有幼体的体重显著高于1周前的幼体（P= 0.008），显示出正常的生长效应。在HE后2周，HE + p38 MAPK抑制幼体的体重显著高于对照组（P< 0.001）。在对照组和HE组中，体重随时间推移无显著影响。
在HE后的不同时间点，对照组和HE + p38 MAPK抑制组在全身性缺氧暴露（HE）后2周时的体长显著长于同组在HE后1周时的体长（分别为P= 0.001 和 P= 0.0002）。在HE后2周，接受HE + p38 MAPK抑制的幼体体长显著长于仅接受HE的幼体（P= 0.005）。
关于HE和p38 MAPK抑制对斑马鱼幼体生长的影响，在HE后2周，有和没有p38 MAPK抑制的HE组的Fulton氏状态因子（K）均显著高于对照组（分别为P= 0.005 和 P= 0.003）。HE后不同时间点之间无显著差异（P= 0.78）。
3.3 从启动室出现的时间
在HE后的相同时点比较幼体组时，从启动（暗）室出现的延迟时间无显著差异（P= 0.99）。与对照组相比，急性重度缺氧暴露和重度缺氧暴露 + p38 MAPK抑制对从启动室出现的时间无显著影响（分别为P= 0.96 和 P= 0.80）。
然而，无论实验组如何，在HE后2周，幼体从启动室出现的时间显著缩短。在HE后2周，斑马鱼幼体从启动室出现的时间显著缩短（P= 0.03）。HE后1周的对照组比HE后2周的对照组多花费96%的时间才出现（P= 0.004）。类似地，HE组在HE后1周从启动室出现的时间比HE后2周的幼体长96%（P = 0.024）。接受HE + p38 MAPK抑制的幼体在HE后1周的出现时间比HE后2周长117%（P= 0.03）。
3.4 在竞技场区域停留的时间
将从启动室出现的时间用作协变量，以分析其对在竞技场每个区域停留时间的影响。p38 MAPK抑制剂对在趋触性区域停留的时间有显著影响（P= 0.02），而HE后的周数无显著影响（P= 0.09）。考虑到出现时间作为协变量，在HE后1周，接受HE + p38 MAPK抑制的幼体在趋触性区域停留的时间（基于估计边际均值为17%）显著多于未接受p38 MAPK抑制的HE组（P= 0.04）。对照组、HE组和HE + p38 MAPK抑制组在趋触性区域停留的时间在HE后1周和2周之间无差异（分别为P= 0.25， P= 0.2 和 P= 0.91）。从启动室出现的时间对在趋触性区域停留的时间有显著影响（P= < 0.001）。
在区域1停留的时间在任何时间点在组间无显著差异（P= 0.92），在HE后的不同时间点也无差异（P= 0.19）。处理因素对在区域2和区域3（新奇物体区域）停留的时间无显著差异（分别为P= 0.11 和 P= 0.94），急性重度缺氧暴露后的日龄因素也无显著差异（分别为P= 0.41 和 P= 0.97）。然而，当将从启动室出现的时间作为协变量时，在HE后2周，HE组在新奇物体区域停留的时间显著少于对照组（P= 0.04）。当考虑到出现时间作为协变量时，在HE后2周的对照组在新奇物体区域（区域3）停留的时间显著长于HE后1周的对照组（P= 0.02）。然而，协变量无显著影响（P= 0.65），因此绘制了观测均值。区域0-3的带协变量双向方差分析结果报告见表1。
3.5 到新奇物体的平均距离——新事物好奇
在HE后的相同时点，组间无显著差异（P = 0.94），在HE后的周数间也无显著差异（P= 0.3
