《Frontiers in Immunology》：Associated uncertainty estimation during the validation process of TCID50 and FRNT neutralization assays against SARS-CoV-2 variants, used in population surveillance research and correlates of protection
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本综述系统阐述了在ISO/IEC 17025:2017认证实验室内，针对SARS-CoV-2变异株（包括Wuhan、BA.2、BA.5、XBB.1、JN.1）的50%组织培养感染剂量微量中和（TCID50MN）与荧光灶减少中和试验（FRNT）两种方法的完整验证过程。研究不仅评估了方法的分析性能（灵敏度、特异性、重复性、中间精密度、准确度与稳健性），还首次报道了与每种方法相关的不确定度估计。结果表明，两种方法均能可靠检测中和抗体（nAbs）活性，其中FRNT具有更高灵敏度，但分析员间变异较大。该工作为符合国际标准的中和抗体定量提供了经过验证的框架，其不确定度声明与持续的内部质量控制，显著增强了这些检测在疫苗诱导免疫保护相关性研究与决策中的诊断能力与监管合规性。
2 材料与方法
研究基于ISO/IEC 17025:2017认证实验室环境，使用表达SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike protein）的复制型水泡性口炎病毒（VSV）伪病毒系统，针对五种SARS-CoV-2变异株（Wuhan、BA.2、BA.5、XBB.1、JN.1）进行评估。细胞系使用Vero E6细胞。血清样本包括疫情前的阴性样本、SARS-CoV-2 PCR阳性个体的样本，以及由阳性个体混合制备的血清池（HLSP、MLSP、LLSP、V-LIT-POOL-3）。所有设备均经过维护、校准与确认。
2.1 验证参数
验证遵循国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2（R2）、Eurachem及《测量不确定度表达指南》（GUM）等国际指南。定性参数（选择性、灵敏度、特异性、阳性预测值PPV、阴性预测值NPV、阳性诊断可靠性PDR、阴性诊断可靠性NDR）通过2×2列联表与卡方检验评估，接受标准为灵敏度等参数≥0.95，NDR<0.05。精密度参数（重复性、中间精密度）以几何变异系数（GCV）≤30%为接受标准。准确度/偏倚以回收率在80%-120%之间为合格。稳健性通过改变病毒-样本混合物在细胞单层上的吸附时间（标准时间±15分钟）进行评估。
2.2 TCID50微量中和试验
该方法通过观察细胞病变效应（CPE）来判定中和效果。将系列稀释的血清样本与固定剂量（2500 TCID50/mL）的伪病毒在体外中和后，接种至Vero E6细胞单层，72小时后观察细胞病变。使用Spearman-K?rber算法计算半数有效浓度（EC50）和抑制稀释度。
2.3 荧光灶减少中和试验
该方法通过检测绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的表达来量化中和效果。操作与TCID50MN类似，但使用不同浓度的伪病毒（4000或8000 FFU/mL），并在感染24小时后使用ImmunoSpot S6仪器自动捕捉并计数荧光灶。使用四参数非线性逻辑回归（4PL）模型计算半数抑制浓度（IC50）。
2.4 相关不确定度估计
不确定度估算严格遵循GUM指南。对于TCID50MN，基于Spearman-K?rber数学模型，将中间精密度（涵盖仪器、环境、分析员、试剂等因素）的标准差作为典型测量不确定度，进而计算合成标准不确定度和扩展不确定度。对于FRNT，则基于4PL数学模型，考虑影响荧光灶计数和IC50计算的所有变量（如底部响应值、顶部响应值、Hill斜率等）的不确定度分量，结合中间精密度，最终求得扩展不确定度。
3 结果
3.1 分析性能评估
两种方法对所有测试变异株均显示出卓越的分析性能。TCID50MN和FRNT的灵敏度、特异性、PPV、NPV、PDR均为1.0，NDR为0，完全满足预定接受标准，表明两种方法均能清晰、可靠地区分阳性和阴性样本。
3.2 精密度：重复性与中间精密度
两种方法在不同血清池和变异株上均表现出良好的精密度。重复性评估中，两种方法的GCV差异在0.42%至4.28%之间，其中武汉株在低浓度水平的差异最小。在所有测试中，GCV均低于30%的接受标准。中间精密度（反映实验室内不同分析员、不同日期间的变异）的GCV差异范围增大（0.69%至5.28%），其中JN.1变异株的差异最大，且FRNT的GCV普遍高于TCID50MN。双因素方差分析表明，对于武汉株和XBB.1变异株，分析员和方法两个因素均对结果有显著影响，但它们的交互作用不显著。
3.3 准确度/偏倚
通过回收实验评估准确度。在TCID50MN试验中，分析员1的偏倚通常高于分析员2；而在FRNT中，偏倚在两位分析员间分布更均匀。所有情况下，回收率均在80%-120%的合格范围内，且差异无统计学意义。
3.4 稳健性
改变病毒-样本混合物吸附时间（±15分钟）并未对两种方法的检测结果产生显著影响。TCID50MN（针对武汉株）和FRNT（针对武汉株、XBB.1、JN.1）的回收率均保持在可接受范围内，证明方法对操作中的微小变动不敏感。
3.5 相关不确定度估计
研究成功为每位分析员及每种刺突蛋白变异株估算了扩展不确定度。在TCID50MN中，分析员1的不确定度值在除BA.5外的所有变异株中均较高。在FRNT中，针对武汉株三种血清池水平计算的不确定度值，均高于针对XBB.1和JN.1变异株的估值。不确定度的量化提供了结果可信度的区间范围，增强了数据的可比性和决策的可靠性。
3.6 内部质量控制
通过超过9个月的持续监测，使用Levey-Jennings控制图和Westgard规则对TCID50MN试验进行稳定性评估。期间所有检测结果均未因超出3个标准差而被拒绝，验证了测量的长期精密度和准确度，为“客观不确定度”的建立提供了数据基础。
4 讨论
本研究对TCID50MN和FRNT两种中和抗体检测方法进行了系统验证，并首次全面报告了其相关不确定度。尽管FRNT方法因基于荧光计数的读值系统而表现出更高的灵敏度，但其分析员间的变异也相对较大。TCID50MN则显示出更低的变异性。两种方法在分析性能、稳健性上均表现优异，且稀释因子的选择（如1:3对比1:5）可能对最终滴度有微妙影响。在COVID-19疫苗评估中，多种中和抗体检测方法并存，导致保护阈值难以统一。世界卫生组织（WHO）建立国际标准血清旨在解决此问题。本研究超越常规方法描述，通过完整的验证流程和不确定度评估，为生成具有监管决策价值的数据提供了坚实框架。使用VSV伪病毒系统，在保证生物安全性的同时，获得了与活病毒相媲美的结果，是经济高效的技术替代方案。
5 结论
本研究表明，经过验证的TCID50MN和FRNT微量中和试验是检测和定量SARS-CoV-2变异株中和抗体的可靠工具。两种方法均满足ISO/IEC 17025:2017等国际标准对质量和技术能力的要求。FRNT具有更高灵敏度，而TCID50MN则精密度更佳。将不确定度估计整合到验证过程中，显著增强了结果的可信度和透明度，对于疫苗保护相关性研究、群体免疫监测以及监管机构审批决策具有关键价值。该工作建立了一个经过验证的标准化框架，为应对不断演变的SARS-CoV-2变异株和未来新发传染病的免疫学研究与疫苗评估提供了重要技术支撑。
