《Frontiers in Molecular Biosciences》：Multi-omics integration identifies PGAP3 as a tumor-intrinsic factor associated with CD8+ T-cell exclusion in prostate cancer
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本研究通过整合孟德尔随机化（MR）、转录组学与单细胞空间分析，鉴定出PGAP3是前列腺癌（PCa）中与代谢重编程和CD8+T细胞低浸润相关的关键肿瘤内在基因，揭示了其作为免疫“冷”肿瘤微环境潜在标志物的价值，为探索靶向免疫逃逸新策略提供了线索。
1 引言
前列腺癌（PCa）是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，其免疫学特征通常表现为“冷”肿瘤，以低肿瘤突变负荷、稀疏的CD8+T细胞浸润和对免疫检查点阻断（ICIs）的抵抗为特点。肿瘤细胞内在的免疫逃逸程序在此背景下仍未完全阐明。本研究旨在通过整合多组学方法，鉴定驱动前列腺癌免疫逃避的关键肿瘤内在基因，并探讨其功能。
2 材料与方法
研究采用了一种整合的多组学框架。首先，利用孟德尔随机化（MR）方法，整合前列腺癌全基因组关联研究（GWAS）数据和表达数量性状基因座（eQTL）数据，在多个队列中进行转录组范围的孟德尔随机化（TWMR）和基于汇总数据的孟德尔随机化（SMR），以初步筛选候选基因。所使用的GWAS数据包括一个大型多血统荟萃分析（122,188例病例和604,640例对照）以及独立的FinnGen队列（15,199例病例和131,266例对照）。eQTL数据来自eQTLGen联盟和GTEx（v8）项目的前列腺组织特异性数据。
接着，结合来自TCGA-PRAD、GEO（GSE97284）等数据库的批量RNA测序数据、单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE181294）以及空间转录组学（ST）数据（GSE230282），对候选基因进行细胞和空间层面的深入表征。单细胞数据分析利用Seurat进行质控、整合和细胞亚群注释，并通过scMetabolism和CellChat等工具分别评估代谢通路活性和细胞间通讯。空间转录组数据用于可视化基因表达模式，并利用RCTD算法进行空间点去卷积，分析PGAP3高表达恶性细胞区域与免疫细胞（特别是细胞毒性CD8+T细胞）的空间关系。
免疫浸润分析通过TIMER 2.0、ESTIMATE算法和TCellSI算法进行，评估PGAP3表达与CD8+T细胞丰度、肿瘤微环境评分及T细胞功能状态的关系。此外，从人类蛋白质图谱（HPA）数据库获取了PGAP3的免疫组化与免疫荧光数据，并通过PheWAS和SUMMER数据库分析了PGAP3位点与表型及生存的关联。
最后，在体外功能实验中，通过siRNA在C4-2和DU145前列腺癌细胞系中敲低PGAP3表达，利用CCK-8、克隆形成、划痕愈合和Transwell迁移实验验证PGAP3对细胞增殖、克隆形成能力和迁移能力的影响。所有统计分析均在R软件中完成，显著性水平设定为P < 0.05。
3 结果
3.1 利用孟德尔随机化鉴定前列腺癌风险基因
通过TWMR和SMR分析，在初步筛选和验证阶段分别鉴定出507个和326个与前列腺癌风险相关的基因。将两种MR方法鉴定的基因取交集，最终确定了五个稳健的候选基因：VAMP3、DRAM2、RNASEH2C、PYROXD2和PGAP3。其中，VAMP3和PGAP3显示出增加患病风险的作用。基于PGAP3在恶性上皮细胞中的选择性高表达，研究将其作为后续深入分析的重点。
3.2 PGAP3在恶性上皮细胞中选择性表达并与PCa进展和预后相关
单细胞转录组分析显示，PGAP3的表达在肿瘤微环境的各种细胞类型中具有高度异质性，其表达显著富集于恶性上皮细胞亚群，而在其他免疫或间质细胞中表达较低。人类蛋白质图谱的数据证实，PGAP3蛋白主要定位于细胞质，且在前列腺癌组织中的表达强度高于正常组织。表型范围关联研究（PheWAS）显示，PGAP3基因位点的变异与多种肿瘤相关表型显著关联，其顶级单核苷酸多态性（SNP）rs2952152与前列腺癌患者的总生存期和癌症特异性生存期显著相关，提示其潜在的预后价值。
进一步，研究将恶性上皮细胞分为PGAP3阳性（PGAP3+）和PGAP3阴性（PGAP3-）亚群。发育轨迹分析显示，PGAP3表达随肿瘤细胞进展状态而变化。PGAP3+恶性细胞的标志基因在疾病本体（DO）富集分析中显著富集于前列腺癌等肿瘤相关条目。基于PGAP3+恶性细胞标志基因构建的诊断和预后模型，在训练集和独立验证集中均表现出良好的区分性能，表明PGAP3相关的转录程序具有重要的临床意义。
3.3 PGAP3相关的代谢重编程与前列腺癌中的免疫排斥
基因集富集分析（GSEA）和单细胞代谢通路分析显示，PGAP3+恶性细胞表现出全局性的代谢活性升高，尤其富集于生物素代谢、天冬氨酸/天冬酰胺代谢、硫代谢、亚油酸代谢以及PP2A相关通路等。这提示PGAP3高表达的肿瘤细胞处于一种特定的代谢重编程状态。
在免疫微环境方面，细胞通讯（CellChat）分析揭示了PGAP3+恶性细胞与细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）之间存在独特的配体-受体信号模式。空间转录组学分析发现，PGAP3+恶性细胞富集区域与CTLs高信号区域在空间上显著分离，表现出免疫排斥的特征。在TCGA-PRAD队列的批量数据分析中，PGAP3高表达的肿瘤具有更低的ESTIMATE评分、更高的肿瘤纯度，并且CD8+T细胞的浸润水平普遍呈负相关。TIMER 2.0分析也支持PGAP3表达与多种癌症中CD8+T细胞丰度呈负相关。此外，PGAP3高表达肿瘤中趋化因子CXCL14以及免疫刺激分子TNFSF13B和TNFSF18的表达水平显著降低，这些分子对T细胞的招募和活化至关重要。这些发现共同表明，PGAP3高表达的肿瘤呈现出代谢重编程、免疫抑制因子表达下降以及CD8+T细胞浸润减少相关联的“免疫冷”表型。
3.4 PGAP3在前列腺癌细胞中的功能验证
实验证实，在前列腺癌细胞系C4-2和DU145中，PGAP3在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于非恶性的前列腺上皮细胞RWPE-1。利用siRNA成功敲低PGAP3后，细胞的增殖能力（CCK-8实验）、克隆形成能力以及迁移能力（划痕愈合和Transwell实验）均受到显著抑制。这些体外功能实验直接证明了PGAP3在维持前列腺癌细胞恶性表型中的重要作用。
4 讨论
本研究通过整合遗传学、转录组学和功能实验，系统性地将PGAP3确立为前列腺癌中一个关键的肿瘤内在因子。PGAP3的表达与特定的代谢重编程程序以及免疫“冷”微环境特征（特别是CD8+T细胞的排斥）密切相关。虽然本研究揭示了这些强烈的关联，但PGAP3直接调控代谢通路或免疫分子（如CXCL14）的具体机制，以及其如何最终导致CD8+T细胞排斥，仍需在免疫健全的体内模型中进行更深入的机制探索。此外，PGAP3相关的转录特征在诊断和预后模型中的良好表现，支持了其作为生物标志物的潜在价值。
5 结论
综上所述，本研究通过多组学整合分析，鉴定出PGAP3是前列腺癌中与代谢重编程和CTL/CD8+T细胞低浸润的免疫“冷”微环境相关的肿瘤内在基因。研究结果支持PGAP3作为免疫冷肿瘤的潜在生物标志物，并为未来在免疫健全体系中开展靶向PGAP3及其相关通路的机制研究与治疗探索提供了依据。
