Sprouty2缺失对树突状细胞淋巴结归巢与CD8+T细胞启动功能无显著影响

《Frontiers in Immunology》：Intact lymph node homing and CD8+ T-cell priming abilities of Sprouty2-deficient dendritic cells

本文为一项关于Sprouty2（Spry2）在树突状细胞（DCs）中功能的首个系统性研究。研究通过构建CD11c特异性Spry2敲除小鼠模型，发现尽管Spry2在DCs成熟过程中表达受到调控，但其完全缺失并不影响DCs的正常分化、CCR7介导的迁移、淋巴结归巢以及CD8+T细胞的活化和增殖能力。即使在急性病毒感染模型中，Spry2缺陷的DCs仍能诱导正常的CD8+T细胞效应分化。该研究明确了Spry2并非DCs关键免疫功能的必需调节因子，其结果与Spry2在T、B细胞中的已知作用形成鲜明对比，进一步印证了Spry2功能的细胞类型和情境依赖性。

　　

引言

Sprouty2（Spry2）是MAPK-ERK信号通路的关键调节因子，以高度依赖细胞类型和环境的方式发挥正向或负向调控作用。虽然其在非免疫细胞迁移中的作用已被广泛认知，但在免疫细胞中的功能，尤其是在树突状细胞（DCs）中的作用，尚属未知。DCs作为连接先天与适应性免疫的桥梁，其向引流淋巴结（dLNs）的迁移及启动T细胞应答的能力至关重要。本研究旨在探究Spry2在DCs中的角色。

结果

1. Spry2缺陷DC的体内外分化正常

从公开数据库和小鼠模型分析发现，Spry2在多种DC亚群中均有表达。通过将Spry2^fl/fl小鼠与表达CD11c-Cre的小鼠杂交，成功构建了DC特异性Spry2敲除（Spry2^-/-）小鼠模型。蛋白质印迹分析证实Spry2在敲除的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）中被有效删除，并且Spry2蛋白水平在脂多糖（LPS）诱导的成熟过程中下调。然而，与野生型（Spry2^+/+）相比，Spry2^-/-的BMDCs在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）驱动的体外分化中，产生CD11c⁺MHC-II⁺细胞的比例正常。成熟标记物CD40、CD80、CD86以及趋化因子受体CCR7的表达上调也未受影响。体内分析显示，在脾脏和皮肤引流淋巴结中，浆细胞样DCs（pDCs）、传统1型DCs（cDC1s）和2型DCs（cDC2s）的频率在Spry2^+/+与Spry2^-/-小鼠间无显著差异。Flt3L驱动的体外分化也产生相似频率的各DC亚群。这些数据表明，Spry2的缺失不影响DCs在体内外的正常分化。

2. Spry2缺陷的成熟BMDCs具有高效的CCR7驱动迁移和淋巴结归巢能力

为探究Spry2在DC迁移中的作用，研究首先进行了体外迁移实验。在二维Transwell迁移实验中，Spry2^-/-的成熟BMDCs对梯度浓度CCL19的迁移反应与野生型相当。在更接近生理条件的三维胶原迁移实验中，将DCs包埋于胶原基质并暴露于CCL19梯度下，通过延时显微镜观察发现，Spry2^-/-DCs的迁移速度、方向性和前向迁移指数（FMI）均与野生型无差异。

随后，研究评估了Spry2缺失对DCs体内淋巴结归巢能力的影响。将分别用不同荧光染料标记的野生型和Spry2^-/-成熟BMDCs以1:1比例混合，注射入受体小鼠的足垫。24小时后，在引流腘窝淋巴结（dPLN）的CD11c⁺MHC-II^high迁移性DCs群体中，检测到两种细胞以相似效率到达，而在对侧淋巴结中均未检测到。这表明Spry2缺失不影响BMDCs的体内淋巴结归巢。

3. Spry2缺陷的皮肤定居DCs迁移有效

研究进一步利用两种方法探究了皮肤定居DCs（包括朗格汉斯细胞和真皮DCs）的迁移。首先，在离体爬出实验中，将小鼠耳片置于含CCL19和CCL21的培养基中，Spry2^-/-与野生型小鼠皮肤中CD11c⁺MHC-II⁺DCs的初始频率相似，且从皮肤外植体中迁移出来的DCs频率和绝对数量也无差异。其次，在体内FITC皮肤涂抹实验中，于小鼠腹部涂抹FITC溶液诱导炎症后，在引流淋巴结中迁移而来的CD11c⁺MHC-II^highFITC⁺DCs比例在两组小鼠间也相同。这些结果一致表明，Spry2缺失不影响皮肤DCs在炎症条件下的CCR7依赖性淋巴结归巢。

4. Spry2缺陷的DCs表现出有效的CCR7介导的ERK活化、抗原摄取和CD8⁺T细胞体外启动能力

Spry2是ERK1/2信号的关键调节因子。用CCL19刺激成熟BMDCs可诱导ERK1/2和AKT的瞬时磷酸化。蛋白质印迹分析显示，Spry2^-/-BMDCs中ERK1/2的磷酸化动力学和强度与野生型相似，而AKT的磷酸化在刺激后2分钟达到峰值，且在敲除细胞中略有增强，但功能性后果不显著。

抗原摄取实验表明，Spry2^-/-的不成熟BMDCs对FITC-葡聚糖的摄取能力与野生型相当，随时间推移稳定增加。在体外T细胞启动实验中，用不同浓度SIINFEKL肽段脉冲的Spry2^-/-成熟BMDCs与CellTrace Violet标记的OT-I CD8⁺T细胞共培养72小时。结果显示，两组DCs诱导T细胞增殖的能力相似，表现为相近的增殖曲线、分裂指数、增殖指数以及T细胞活化标记CD25的表达水平。因此，Spry2缺陷并不损害DCs的抗原摄取和体外CD8⁺T细胞启动能力。

5. Spry2缺陷的DCs在急性病毒感染期间诱导正常的CD8⁺T细胞效应分化

为评估Spry2缺失是否影响DCs在生理环境下启动T细胞免疫应答的能力，研究用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）-WE静脉感染小鼠。在感染后第8天（细胞毒性T细胞应答高峰期），分析脾脏和淋巴结中内源性CD8⁺T细胞的应答。

结果显示，两组小鼠脾脏和淋巴结中CD8⁺T细胞的频率相似。表型分析表明，绝大部分CD8⁺T细胞为CD44⁺CD62L^-的效应/效应记忆T细胞（T_E/EM），其比例在两组间无差异。根据杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）和IL-7受体α链（IL-7Rα）的表达，可将效应CD8⁺T细胞分为终末效应细胞（KLRG1⁺IL-7Rα^-）、记忆前体细胞（KLRG1^-IL-7Rα⁺）和双阳性细胞（KLRG1⁺IL-7Rα⁺），这三类细胞的比例在Spry2^+/+与Spry2^-/-小鼠中也无显著不同。决定T细胞命运的转录因子T-bet和Eomes的表达水平在两组间也相当。

最后，通过用LCMV特异性肽段GP_33-41对细胞进行体外再刺激，检测干扰素γ（IFNγ）的产生。结果显示，产生IFNγ的CD8⁺T细胞频率及其IFNγ的表达量在两组小鼠间均无差异。这些数据表明，在急性病毒感染背景下，Spry2缺陷的DCs仍能正常诱导CD8⁺T细胞的效应分化。

讨论

成熟DCs向引流淋巴结的定向归巢及随后对初始T细胞的启动，对于塑造有效的适应性免疫应答至关重要。本研究首次通过遗传学手段在DCs中特异性敲除Spry2，系统评估了其在DCs中的功能。尽管数据库和实验均证实Spry2在DCs中表达，且在成熟过程中下调，提示其可能具有调节作用，但一系列体内外功能实验却得出了意外的阴性结果。

研究发现，Spry2的完全缺失并不影响DCs的多个核心免疫功能：包括体内外的正常分化、CCR7介导的体内外迁移和淋巴结归巢、抗原摄取以及CD8⁺T细胞的启动。即使在急性病毒感染的生理模型中，由Spry2缺陷DCs启动的CD8⁺T细胞也能正常分化为功能完整的效应细胞亚群。信号传导分析显示，CCL19刺激引起的ERK1/2活化在敲除细胞中未受影响，而AKT的磷酸化水平虽有轻微升高，但未观察到相应的功能表型改变。

这一结果与Spry2在B细胞和T细胞中已被报道的显著调控作用形成鲜明对比。在B细胞和CD4⁺T细胞中，Spry2缺失会损害细胞应答；而在CD8⁺T细胞中，Spry1/2的双敲除反而有助于记忆形成。这种差异突显了Spry2功能的细胞类型特异性和情境依赖性。在DCs中，Spry2可能因其表达在活化后下调而功能受限，或者其功能被其他Sprouty家族成员（如Spry1）冗余补偿，这有待未来研究验证。

总之，本研究提供了关于Spry2在DCs中功能的明确证据，表明其并非DCs执行关键免疫功能所必需的调节因子。这些发现不仅增进了对Spry2免疫调节功能多样性的理解，也为后续针对DCs迁移和功能的调控研究排除了一个潜在的非相关靶点。