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本文针对侵袭性皮肤癌黑色素瘤常规治疗抵抗性高的问题，开展了基于橄榄油和迷迭香油的天然植物油纳米结构脂质载体(NLC)负载槲皮素(QR)用于局部治疗的研究。研究成功构建了QR-OO-NLC、QR-RO-NLC及QR-30RO30OO-NLC三种纳米递送系统，经体外评估显示，所制备的NLC具有高抗氧化活性、良好的皮肤细胞生物相容性、高效的细胞摄取与核内递送能力，并在3D黑色素瘤皮肤模型(MSm)中展现出显著的抗肿瘤效果，可消除浅表黑色素瘤并减少真皮肿瘤簇。该研究为开发基于天然植物油与生物活性化合物的局部抗黑色素瘤纳米疗法提供了新策略。
皮肤，作为人体最大的器官，不仅是物理屏障，也常常是癌症的“门户”。其中，黑色素瘤以其高侵袭性和易转移的特性，成为最致命的一种皮肤癌。尽管手术切除是标准疗法，但对于多发性病灶或癌前病变的患者，局部治疗是重要的辅助或替代选择。然而，传统的局部给药方式常面临药物难以穿透皮肤角质层、在病灶处蓄积不足、以及可能带来全身性副作用等挑战。与此同时，一些源自大自然的天然化合物，因其多靶点和相对安全的特性，在癌症防治领域展现出巨大潜力。例如，广泛存在于果蔬中的黄酮类化合物槲皮素(QR)，已被证实具有抗氧化、抗炎和抗癌等多重生物活性，尤其能通过诱导氧化应激和细胞凋亡来抑制黑色素瘤。可惜的是，QR的水溶性极差，生物利用度低，限制了其直接应用。如何将QR高效、精准地递送到皮肤深处的肿瘤部位，是科研人员亟待解决的难题。纳米技术的兴起为这一难题带来了曙光。纳米结构脂质载体(NLC)作为一种先进的药物递送系统，能够包裹疏水性药物，提高其稳定性和皮肤渗透性。更有趣的是，研究者们将目光投向了同样具有生物活性的天然植物油，如富含酚类化合物的橄榄油(OO)和以抗氧化、抗炎特性闻名的迷迭香油(RO)，思考能否将它们不仅作为载体，更作为协同治疗的组分。基于此，由Madalena Duque、Philipp Renn、Abel Oliva和Dragana Barros组成的研究团队在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》上发表了一项研究，他们设计并评估了基于OO和RO的NLC负载QR，用于黑色素瘤局部治疗的潜力。这项研究探索了天然成分与纳米技术结合，开发一种高效、低毒的抗黑色素瘤局部新疗法的可能性。
为开展此项研究，研究人员采用了从纳米制剂制备到复杂体外模型评估的一系列关键技术。首先，他们采用微型乳化-超声法制备了以肉豆蔻酸为固体脂质，以不同比例OO和RO为液体脂质的负载与未负载QR的NLC。利用动态光散射(DLS)和ζ电位分析对纳米粒的粒径、多分散指数(PDI)和稳定性进行了长达3个月的表征。通过高效液相色谱(HPLC)测定了QR的包封率(EE)和载药量(DL)。采用差示扫描量热法(DSC)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析了纳米粒的结晶状态和化学相互作用。抗氧化活性通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除实验评估。在生物学评价方面，研究使用了二维(2D)细胞培养（人永生化角质形成细胞HaCaT、人真皮成纤维细胞HDFn、黑色素瘤细胞A375）和三维(3D)皮肤模型。3D模型包括重建人表皮模型(RHE)、全层皮肤模型(FTSm)以及本研究核心的黑色素瘤皮肤模型(MSm)，后者是在FTSm基础上引入A375黑色素瘤细胞构建而成。利用MTT法在2D和3D模型上评估了纳米系统的细胞毒性。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术(FC)研究了NLC在细胞中的摄取行为。最后，使用Franz扩散池在FTSm和MSm上进行了渗透实验，并通过组织学分析和荧光显微镜观察了纳米粒在皮肤中的分布及其对肿瘤形态的影响。
3.1. NLCs的物理化学表征
3.1.1. 油脂类型影响NLC的物理化学性质
研究人员成功制备了负载0.5% QR的QR-OO-NLC、QR-RO-NLC和两者混合的QR-30RO30OO-NLC。所有系统的粒径均在177-199纳米之间，适合局部给药。zeta电位绝对值均高于30 mV，表明胶体稳定性良好。与未负载系统相比，QR的加入对粒径和PDI的影响因油脂组成而异。在含RO的系统中，QR的加入对粒径影响较小（变化<7%），而在OO-NLC中，QR的加入使粒径增大了20%，PDI增大了16%。这可能与QR在RO中溶解度更高，能更好地融入脂质基质有关。
3.1.2. QR的包封影响长期稳定性
对纳米粒进行了为期3个月的稳定性监测。未负载QR的NLC在大小和PDI上表现出良好的时间稳定性。而负载QR的NLC在3个月内粒径有所减小（减少10-15%），PDI也降低，表明初始可能存在疏松聚集体，随时间发生降解或沉淀，最终悬浮的NLC群体平均粒径变小、分布更均一。所有系统的zeta电位在3个月内均保持高于30 mV的绝对值，表明物理稳定性良好。
3.1.3. 包封效率和载药量
所有QR-NO-NLC系统的包封效率(EE)极高，接近100%，载药量(DL)均为16.66%。
3.1.4. NLC配方的晶体结构受油脂类型和QR包封的影响
DSC分析表明，与纯固体脂质肉豆蔻酸相比，所有NLC的熔点均显著降低，结晶度指数(CI)低于24%，表明其脂质基质处于无定形态。负载QR后，NLC的熔点、熔融焓和CI普遍进一步降低，但在QR-RO-NLC中观察到结晶度略有增加。所有NLC的熔点均高于37°C，适合局部给药。
3.1.5. FTIR光谱显示QR成功掺入NLC纳米结构
FTIR光谱分析证实，在QR-NO-NLC中可同时检测到肉豆蔻酸和QR的特征峰，且特征峰发生了偏移和改变，表明QR成功掺入新形成的纳米结构中，并与脂质基质存在分子间相互作用。
3.2. QR-NO-NLC的体外抗氧化活性
DPPH自由基清除实验评估了系统的抗氧化活性。纯QR溶液显示出98.9%的高清除活性。所有负载QR的NLC也表现出强的抗氧化活性，QR-OO-NLC、QR-30RO30OO-NLC和QR-RO-NLC的清除率分别为87.3%、86%和81.1%，均显著高于对应的未负载NLC。这表明QR的掺入增强了NLC的抗氧化能力，QR与油脂中的酚类化合物可能存在协同作用。
3.3. 生物相容性研究
3.3.1. QR-NO-NLC对A375的细胞毒性受油脂组成影响
MTT实验评估了NLC在HaCaT、HDFn和A375细胞上的毒性。未负载NLC在浓度高于2.5 mg/mL（以总脂质浓度计）时对所有细胞系均显示细胞毒性。浓度≤1 mg/mL时，除HDFn细胞对RO-NLC外，基本无毒。QR纯溶液对所有测试细胞均有毒。有趣的是，负载QR的NLC对A375细胞的毒性模式发生了变化：QR-RO-NLC的细胞毒性随浓度降低而增加，而引入OO的QR-30RO30OO-NLC和QR-OO-NLC则呈现典型的浓度依赖性毒性，且QR-OO-NLC在所试浓度下对A375无细胞毒性。这表明QR与不同油脂的相互作用可能改变了其对黑色素瘤细胞的生物学效应。
3.3.2. 在3D RHE模型上未观察到NLC的细胞毒性效应
根据OECD指南，在RHE模型上进行皮肤刺激性测试。结果显示，在25 mg/mL的高浓度下，仅RO-NLC使细胞活力降至50%以下，被归类为皮肤刺激物。而所有负载QR的NLC及QR纯溶液均未表现出刺激性。这凸显了3D模型相比2D单层细胞在预测局部毒性方面的差异和优势。
3.3.3. 通过共聚焦扫描激光显微镜进行细胞摄取分析
CLSM观察显示，用DiO荧光染料标记的空NLC主要定位在HaCaT、HDFn和A375细胞的细胞质近核区。而QR纯溶液和负载QR的NLC（QR自身有荧光）则显示出更强的荧光信号，并且能够穿过核膜，在细胞核内积累。这表明QR-NO-NLC不仅能被细胞有效摄取，还能将QR递送至细胞核内，这对于其发挥调控基因表达、诱导凋亡等抗肿瘤作用至关重要。
3.4. 渗透研究和组织学分析
在FTSm和MSm上进行的Franz扩散池渗透实验表明，QR-NO-NLCs中的QR释放呈双相模式：初始快速释放，随后持续释放。24小时后，QR在FTSm中的累积渗透量从QR-OO-NLC的83.1 μg/cm2到QR-30RO30OO-NLC的101.7 μg/cm2不等；在MSm中，则从QR-RO-NLC的20.5 μg/cm2到QR-OO-NLC的48.3 μg/cm2。对处理后的MSm进行组织学分析发现，经QR负载的载体处理后，模型表浅层的黑色素瘤消失，真皮层肿瘤簇减少，同时表皮的完整性得以保持。荧光显微镜进一步证明，纳米粒子在表皮层有显著积累，向真皮的扩散有限。
综上所述，本研究成功设计并表征了基于天然橄榄油和迷迭香油的NLC负载槲皮素用于黑色素瘤局部治疗。所制备的纳米系统粒径适宜、稳定性良好，并能高效包封QR。负载QR的NLC展现出强大的抗氧化活性。重要的是，在2D和3D模型中，这些系统在有效浓度下对正常皮肤细胞显示出良好的生物相容性，同时能通过细胞摄取将QR递送至黑色素瘤细胞核内。渗透研究证实了QR能有效渗透皮肤并在肿瘤模型中蓄积。最关键的发现是，在复杂的3D黑色素瘤皮肤模型中，QR-NO-NLC处理能够消除浅表肿瘤并减少深部肿瘤簇，展现了明确的抗肿瘤效果。这项研究的意义在于，它首次将两种具有已知抗黑色素瘤活性的天然植物油（OO和RO）与具有抗癌潜力的生物活性化合物QR结合，共同构建成一种新型的纳米递送系统。这不仅提高了疏水性药物QR的递送效率，还可能通过油脂与QR的协同作用增强疗效。该研究为开发基于天然成分、低毒高效的局部抗黑色素瘤纳米疗法提供了坚实的实验依据和新的设计思路，推动了天然产物纳米制剂在肿瘤局部治疗领域的发展。
