Tetrastigma hemsleyanum 通过小胞外囊泡介导的星形胶质细胞-小胶质细胞之间的相互作用，抑制 HSPB1/Akt/NF-κB 信号通路，从而缓解发热性惊厥

热性惊厥模型中总黄酮通过调控小胶质细胞与星形胶质细胞的sEVs交互抑制HSPB1/Akt/NF-κB信号通路，表没食子儿茶素可能为关键活性成分。

　　

朱华强|陈倩|严天慈|卢汉宇|李朗凡|宋秦|杜丽静|黄海文|沈思聪|何俊尧|范晓辉|彭鑫

摘要

背景

由高热引起的热性惊厥（FS）通常伴随着炎症，但热量如何引发炎症反应仍不清楚。

方法与结果

我们发现，使用含有36种成分的T. hemsleyanum总黄酮（FTH）进行预处理可以抑制大鼠的热性惊厥。在scRNA-seq数据中，小胶质细胞和星形胶质细胞是两种表现出显著升高的热休克蛋白B1（Hspb1）基因表达的最突出细胞群体。与炎症相关的小胶质细胞E亚群在热性惊厥模型（MD）组中富集，并与对热的反应和MAPK信号通路有关。此外，scRNA-seq和组织小外泌体（sEVs）测序均显示MD组中Hspb1表达升高和MAPK通路激活。通过Transwell共培养实验，我们发现星形胶质细胞通过促进sEVs的释放来刺激小胶质细胞中的高HSPB1蛋白表达。此外，FTH预处理还逆转了海马区HSPB1、Akt和NF-κB信号分子的激活。体外/体内验证实验表明，儿茶素可能是FTH对抗热性惊厥的主要活性成分之一。

结论

我们的结果表明，FTH可能通过抑制海马区的HSPB1/Akt/NF-κB信号通路来缓解热性惊厥，这一过程可能最初是由星形胶质细胞向小胶质细胞释放sEVs触发的。

引言

热性惊厥（FS）是1-5岁儿童因高热而常见的一种疾病（Yi等人，2023年）。一些儿童仅发生一次热性惊厥，称为简单热性惊厥，但大约30-35%的儿童在幼儿期会多次发生热性惊厥（Patel等人，2015年）。研究表明，热性惊厥与海马区的炎症和免疫反应有关（Kong等人，2019年；Li等人，2024年）。重要的是，热性惊厥是早期癫痫发生的一个因素，而复杂的热性惊厥可导致炎症细胞因子的异常表达和海马硬化，这可能引发成人癫痫（Thom，2014年；Vestergaard等人，2007年）。然而，高热促进惊厥的具体病理生理机制仍不清楚。

Tetrastigma hemsleyanum（T. hemsleyanum）是一种用于中医（TCM）的草药，几个世纪以来一直被推荐用于治疗复杂热性惊厥。一项研究表明，T. hemsleyanum总黄酮（FTH）通过调节Treg/Th17免疫平衡，减轻了由Concanavalin A诱导的自身免疫性肝炎小鼠的炎症应激（Ji等人，2019年）。此外，我们最近的研究表明，T. hemsleyanum的乙醇提取物降低了患有热性惊厥的大鼠海马区促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达，以及小胶质细胞激活标志物离子化钙结合适配分子1（Iba1）的表达（Ji等人，2024年）。

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，在与其他CNS细胞的合作中维持体内平衡（Masuda等人，2020年）。小胶质细胞与星形胶质细胞的相互作用表明，小胶质细胞可以产生amphiregulin，从而抑制多发性硬化症中促进疾病的星形胶质细胞反应（Michael A Wheeler等人，2023年）。激活的小胶质细胞通过分泌白细胞介素-1α（IL-1α）、TNF和补体C1q诱导A1型促炎星形胶质细胞的产生（Liddelow等人，2017年）。小胶质细胞还可以通过隧道纳米管从聚集物中拯救神经元（Scheiblich等人，2024年）。最近的研究表明，在颞叶癫痫中，γ-氨基丁酸（GABA）依赖的小胶质细胞消除海马抑制性突触会促进神经元过度兴奋（Chen等人，2025年）。然而，在复杂热性惊厥期间，小胶质细胞也可能取代皮质中的GABA能突触作为保护机制（Wan等人，2020年）。

细胞异质性在疾病发病机制和进展中起着关键作用，是中医辨证分型和综合调节的重要生物学基础（Zhao等人，2020年）。小胶质细胞是CNS中高度异质的细胞群体（Hao等人，2022年；Masuda等人，2020年）。一种创新的高通量技术——单细胞RNA测序（scRNA-seq）提高了我们对疾病进展过程中细胞亚群分布的理解（Tang等人，2009年；Yu等人，2023年）。最新证据表明，外泌体（EVs）在细胞间通讯中起着关键作用，尤其是由抗炎表型的小胶质细胞（M2型小胶质细胞）分泌的小外泌体（sEVs）在调节神经炎症方面发挥重要作用，通过促进或抑制胶质细胞和神经元的激活（D'Egidio等人，2024年）。此外，由抗炎表型的小胶质细胞分泌的小外泌体（sEVs）可以在缺血性中风后促进神经干细胞介导的神经发生，通过抑制神经炎症或促进神经突起生长和促进突触恢复来缓解创伤性脑损伤后的认知障碍（Chen和Wang，2025年；Zhang等人，2025年）。人类小热休克蛋白（HSPB）家族包含十个成员（HSPB1–HSPB10），通过多种功能在细胞应激调节中发挥关键作用（Delalat等人，2025年；Mayer和Bukau，2005年）。这些伴侣蛋白具有不同的细胞活性：某些亚型（HSPB2–6和HSPB8）作为保持酶伴侣，防止蛋白质聚集并帮助重新折叠；其他亚型（如HSPB1和HSPB8）通过自噬和泛素-蛋白酶体途径促进底物降解；多个成员（HSPB1–8）在应激条件下提供细胞保护并抑制促凋亡因子（Tedesco等人，2022年）。其中，HSPB1是研究最广泛的成员之一，已被证明可以响应各种细胞应激源，在氧化应激期间具有抗氧化作用，在化学应激期间具有抗凋亡作用（Liang等人，2023年）。然而，HSPB1是否参与由热应激引起的炎症反应尚不清楚。因此，我们首先对未经FTH预处理和经过FTH预处理的大鼠海马组织进行了scRNA-seq分析。为了阐明细胞间的可能通讯，随后对大鼠海马组织进行了sEVs分析。最后，我们通过Transwell共培养实验或细胞中的NO炎症因子检测，以及对热性惊厥模型大鼠海马区的Western blot蛋白分析或免疫荧光共标记实验来验证信号通路机制。

部分内容摘录

动物

雄性Sprague–Dawley大鼠（50–60克）购自浙江Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.（中国平湖）。实验设计得到了浙江药学院实验室动物使用和护理伦理委员会的批准（20230706），所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》（第八版）的规定进行。

药物制备与鉴定

T. hemsleyanum购自浙江Wuyi

FTH的抗热性惊厥效果及单细胞悬浮液和sEVs的分离

为了阐明FTH对热性惊厥的效果，大鼠接受了热性惊厥模型实验，并在有无FTH预处理的情况下进行测试。在出生后第39天进行测试后，成功从大鼠海马区分离出了单细胞悬浮液和sEVs（图1A）。MD组中每日热性惊厥持续时间的增加表明热性惊厥模型建立成功。相比之下，TH组在33天、35天和37天时FTH预处理显著缩短了热性惊厥持续时间（图1B）。

讨论

在我们的研究中，我们通过分析有无FTH预处理后的大鼠海马区单细胞转录组谱来研究细胞通讯。我们确定小胶质细胞和星形胶质细胞是该疾病模型中的主要细胞群体。此外，这些细胞中的Hspb1、Vim和S100a10 mRNAs的表达在CT、MD和TH组中呈现出倒U形趋势。此外，与炎症相关的小胶质细胞E亚群

结论

总之，我们揭示了小胶质细胞在复杂热性惊厥的发病机制和FTH的抗惊厥机制中的异质性。星形胶质细胞与小胶质细胞通过sEVs的潜在通讯可能会影响关键分子HSPB1的传递，进而调节大鼠海马区的HSPB1/Akt/NF-κB信号通路，这种效应与小胶质细胞的炎症高度相关。FTH和儿茶素可能抑制这种细胞因子放大的信号通路。

资助

本工作得到了浙江省“先锋”和“领头鹅”研发计划（2023C03038）、浙江省自然科学基金（LTGY24H090009、LY23H180002）、宁波市自然科学基金（2024J416、2023J045）、宁波市顶尖医疗与健康研究计划（2022030309）以及浙江药学院学校基金（X2025049）的支持。

数据可用性

单细胞RNA测序数据和sEV RNA测序数据已分别存储在Sequence Read Archive（SRA）数据库中，BioProject访问号为PRJNA1399700和PRJNA1413934。sEV蛋白测序数据已通过PRIDE合作伙伴仓库存储在ProteomeXchange Consortium中，数据集标识符为PXD073525。

作者贡献声明

朱华强：撰写——原始草稿、验证、方法学、正式分析、数据管理、资金获取。陈倩：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。严天慈：方法学、正式分析。卢汉宇：方法学。李朗凡：方法学。宋秦：方法学、资金获取。杜丽静：方法学、正式分析。黄海文：方法学。沈思聪：方法学。何俊尧：监督。范晓辉：撰写——审阅与编辑，

CRediT作者贡献声明

朱华强：撰写——原始草稿、验证、资金获取、正式分析、数据管理。陈倩：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。严天慈：方法学、正式分析。卢汉宇：方法学。李朗凡：方法学。宋秦：方法学、资金获取。杜丽静：方法学、正式分析。黄海文：方法学。沈思聪：方法学。何俊尧：监督。范晓辉：撰写——审阅与编辑、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢Echo Biotech Co., Ltd.的Yuan Wang和Zhonghua Li在sEV测序和生物信息学分析方面的协助。