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黄连木香汤通过调节PI3K-AKT-FTH信号通路抑制铁介导的ferroptosis，改善溃疡性结肠炎症状，为天然疗法提供新机制。
王银英|李天刚|王英|李俊新|宋丽云|傅圆杰|李文远|李莉|邱勇|严金媛|杨中山
摘要
背景
铁代谢紊乱及其引发的铁死亡（ferroptosis）在溃疡性结肠炎（UC）的发病机制中起着关键作用，这突显了铁稳态作为治疗靶点的重要性。黄连木香汤（HMD）是一种传统中药方剂，广泛用于治疗结肠炎等胃肠道疾病。然而，其背后的分子机制尚未完全阐明。
目的
确定HMD中的活性成分，并阐明其在缓解UC方面的作用机制，特别是对铁代谢和铁死亡的影响。
研究设计
小鼠被给予含有3%硫酸葡聚糖钠（DSS）的饮用水，持续7天。3天后，小鼠被随机分配到不同治疗组，分别每日口服HMD（4.29、8.58或17.16克/千克）或柳氮磺吡啶（SASP；250毫克/千克），持续7天。此外，肠道特异性FTH敲除小鼠（FTHf/f; Villin-Cre）也采用相同方案接受低剂量HMD（4.29克/千克）治疗。通过网络药理学方法预测HMD对抗UC的潜在治疗靶点，并在体内和体外模型中进行验证。
方法
使用UHPLC-HRMS技术鉴定HMD中的活性成分。通过结肠炎小鼠模型评估HMD对疾病症状（体重、粪便隐血、存活率、疾病活动指数）、结肠长度、炎症、组织病理学以及紧密连接蛋白表达（Occludin、ZO-1）的影响。通过网络药理学和功能分析预测相关信号通路。通过评估线粒体结构、铁过载及铁死亡相关蛋白（GPX4、FTH）的水平来研究其作用机制。进一步利用肠道特异性FTH敲除小鼠验证FTH的关键作用。同时，通过共免疫沉淀（co-IP）、细胞热位移测定（CETSA）和表面等离子共振（SPR）分析探讨PI3K–AKT–FTH通路，并利用免疫沉淀-质谱（IP-MS）技术鉴定潜在的中间效应因子。
结果
在HMD中鉴定出多种活性成分，包括生物碱、黄酮类和苯丙素类。HMD治疗显著缓解了结肠炎症状，改善了肠道完整性，并增加了紧密连接蛋白的表达，其中低剂量组的疗效与SASP相当。机制研究表明，HMD通过PI3K-AKT通路调节铁代谢并抑制铁死亡，表现为线粒体结构恢复、铁过载减轻以及GPX4和FTH表达增加。肠道特异性FTH敲除小鼠的实验结果进一步证实了FTH的关键作用。此外，共免疫沉淀（co-IP）、细胞热位移测定（CETSA）和表面等离子共振（SPR）分析用于研究PI3K–AKT–FTH通路，而免疫沉淀-质谱（IP-MS）用于鉴定潜在的中间效应因子。
结论
我们的研究发现，HMD通过调节PI3K–AKT–FTH通路抑制FTH介导的铁死亡来缓解结肠炎。这项研究为HMD的治疗机制提供了新的见解，并强调了其作为结肠炎天然疗法的潜力。未来的研究应重点关注HMD的分子靶点及其在UC中的临床应用。
引言
溃疡性结肠炎（UC）是一种主要的炎症性肠病（IBD）亚型，其特征是结肠和直肠的慢性炎症。UC的发生是由遗传易感性、环境和腔内因素以及黏膜免疫失调的复杂相互作用引起的，最终导致结肠黏膜屏障受损（T. Kobayashi等人，2020年）。尽管研究取得了显著进展，但其确切的发病机制仍不明确。肠道黏膜屏障功能障碍被认为是IBD的核心病理特征，在其发展中起着关键作用（Neurath, Artis, & Becker, 2025年）。因此，由于UC治疗的最终目标是恢复黏膜正常功能，迫切需要进一步研究以确定新的治疗靶点。新兴证据表明，铁死亡（一种铁介导的程序性细胞死亡）在鼠模型中对结肠炎的发病机制有重要贡献（S. Wang, Liu, Wang, & Bai, 2020年）。铁稳态由多种因素调节，其中铁蛋白是主要的细胞铁储存蛋白，由铁蛋白轻链（FTL）和铁蛋白重链（FTH）组成。IBD患者的铁蛋白水平降低，这与较低的发病风险相关（Widbom, Ekblom, Karling, & Hultdin, 2020年）。铁在组织修复中起着重要作用，但过量铁会通过Fenton反应引发氧化损伤和炎症（Gu等人，2023年；Q. Luo等人，2021年）。虽然饮食中的铁对于促进肠道损伤后的上皮再生至关重要（Huang等人，2024年），但治疗性补铁在UC患者和动物模型中反而会加重疾病症状（Y. Kobayashi等人，2019年；Gu等人，2023年）。这些发现强调了铁依赖性铁死亡在UC发病机制中的重要性。因此，寻找能够诱导铁死亡的其他物质对于开发更有效的UC治疗方法至关重要。
来自药用植物的天然化合物具有治疗UC的潜力。其中，黄连木香汤（HMD）是一种经典方剂，包含黄连根（Huanglian）、木香根（Muxiang）和橘子果（Zhiqiao），在中国被广泛用于清热、祛湿和促进气机，这与传统理论中UC的症状相符（J. X. Zhang等人，2024年）。HMD的治疗效果部分归因于其主要活性成分小檗碱，临床证明小檗碱可治疗腹泻和胃肠道功能障碍。肠道上皮细胞的存活对于维持肠道屏障至关重要。现有研究表明，小檗碱通过调节炎症介质、免疫反应调节因子和肠道上皮修复机制来影响UC的多种病理过程（Meng, Li, Du, Feng, & Qiu, 2024年；Jing等人，2021年）。小檗碱通过PI3K/AKT信号通路抑制炎症和细胞凋亡（Fang等人，2018年）。研究显示，小檗碱可抑制PI3K/AKT/mTOR通路，从而减少LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中的炎症细胞因子（Meng等人，2024年）。值得注意的是，PI3K–AKT信号通路在UC的发展和进展中起关键作用，其激活会刺激NF-κB、LPS和TNF-α介导的促炎和凋亡信号通路，破坏细胞因子平衡并放大炎症反应（X. Zhang等人，2024年）。尽管已证实HMD具有这些药理作用，但其抗结肠炎作用的完整分子机制仍需进一步阐明。
在本研究中，我们评估了HMD的药理安全性和其在对抗铁过载诱导的铁死亡（UC的关键病理机制）方面的治疗潜力。通过综合实验方法，我们发现HMD通过恢复铁稳态来保护细胞免受铁死亡的影响，这体现在其对Fe2?和Fe3?平衡的显著调节作用上。FTH缺乏会加重小鼠的结肠炎症状，而HMD治疗可缓解这一效应。结合网络药理学和实验验证，我们探讨了HMD的抗UC机制，并确定了PI3K–AKT–FTH信号通路在UC发病机制中的作用。我们的研究表明FTH是铁死亡的新调节因子，并提出激活PI3K–AKT–FTH通路可能是治疗UC的有效方法。
部分内容
动物实验
实验所用C57BL/6J雄性小鼠，年龄为6-8周，来自SBF Biotechnology Co., Ltd.（许可证编号：SCXK (Beijing) 2019–0010）。FTH转基因小鼠和Villin-Cre小鼠来自The Jackson Laboratory。通过基因杂交获得肠道特异性条件性FTH敲除小鼠（FTHflox/flox; Villin-Cre），并通过PCR基因分型进行验证。所有动物在SPF条件下饲养，环境温度为24°C（±1°C），相对湿度为50%，光照周期为12小时
HMD成分的分离及结构鉴定
HMD成分通过UHPLC-HRMS进行分析，鉴定出的化学成分包括小檗碱、 palmatine、coptisine、naringin等（图1A, B）（补充图1, 2）。这些成分可能是HMD中治疗UC的活性成分。本研究鉴定出的主要化合物类别包括shikimates、苯丙素类和生物碱，以及其他次级代谢产物（图1C）。表2详细列出了保留时间和分子式
讨论
目前的治疗方法仍无法治愈UC，即使手术干预也可能导致持续并发症。尽管正在探索包括5-氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂、生物疗法等潜在有效的治疗策略，传统中医（TCM）已成为UC的辅助治疗方法，越来越多的临床证据支持其在缓解症状和减少疾病复发方面的有效性
结论
总之，HMD通过FTH依赖性的铁死亡调节机制来保护肠道免受损伤。我们的体外和体内研究表明，HMD通过抑制PI3K–AKT–FTH信号通路修复肠道屏障并减轻炎症，从而抑制铁积累和随后的铁死亡。这些发现揭示了HMD的新药理机制，并为其作为UC天然治疗策略提供了有力依据。
作者贡献声明
王银英：撰写-原始草稿，概念构思。李天刚：实验研究，数据管理。王英：监督，软件操作。邱勇：资金获取，资源协调。宋丽云：软件使用。严金媛：撰写-审稿与编辑，实验研究。李文远：实验研究，数据管理。杨中山：撰写-审稿与编辑，项目管理，方法学研究，资金获取。李莉：验证，数据管理。傅圆杰：方法学研究。李俊新：数据可视化，形式分析。
作者贡献声明
王银英：撰写-原始草稿，概念构思。李天刚：实验研究，数据管理。王英：监督，软件操作。李俊新：数据可视化，形式分析。宋丽云：软件使用。傅圆杰：方法学研究。李文远：实验研究，数据管理。李莉：验证，数据管理。邱勇：资源协调，资金获取。严金媛：撰写-审稿与编辑，实验研究。杨中山：撰写-审稿与编辑，项目管理，方法学研究，资金获取利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82360017）、云南省科技厅（202201AS070084、202301AZ070001-004、202407AB110020、202403AC100007）以及云南省高校服务型产业科技项目（FWCY-BSPY2024093）的资助。
