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本研究针对中药材中霉毒素污染问题，整合UPLC-Q-TRAP-MS、MCS模拟、SMRT测序及NIRS-机器学习技术，系统评估了4种中药材中19种霉毒素的污染风险，确定了AFB1、ZEN等关键控制对象，并构建了高精度的快速筛查模型，为中药材安全监管提供了新策略。
作者名单：方玲、刘晓康、刘康楠、冯林、唐子军、李振伟、张代迪、杨文志、郭德安
单位：天津中医药大学中医现代化国家重点实验室，中国天津市宝阳湖路10号，邮编301617
摘要
背景
：霉菌毒素是由产毒真菌产生的有毒次级代谢物，由于在可食用和药用植物（EMPs）中的广泛污染及其协同毒性，对人类健康构成了重大威胁。
目的
：本研究旨在设计一种多技术整合策略，用于可食用和药用植物中的霉菌毒素风险评估和早期预警。
方法
：采用超高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱质谱（UPLC-Q-TRAP-MS）对四种可食用和药用植物中的19种霉菌毒素进行定量分析，并利用概率蒙特卡洛模拟（MCS）来量化其膳食暴露风险。随后，通过单分子实时（SMRT）测序技术鉴定这些植物中的产毒真菌。鉴于黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）在Coicis semen中的高污染率以及赭曲霉毒素A（OTA）和链格孢毒素（ST）在Lilii bulbus中的潜在风险，结合近红外光谱（NIRS）和机器学习技术对这些霉菌毒素进行了快速无损检测。
结果
：在259批样品中，有240批（92.66%）至少检测出一种霉菌毒素。概率风险评估结果显示，由于对公共健康的威胁，AFB1、ST、单甲基链格孢醇（AME）和ZEN是重点监测对象。SMRT测序不仅鉴定出Aspergillus、Fusarium和Alternaria为主要产毒真菌，还揭示了这些产毒真菌与其次级代谢物（霉菌毒素）之间的潜在关联。经过评估，k近邻（KNN）和支持向量机（SVM）在低风险和高风险分类中表现优异，测试集对这些目标霉菌毒素的分类准确率均为100%。独立的外部验证证实了这些模型的良好适用性：Coicis semen中的ZEN预测准确率为90%，Coicis semen中的AFB1、Lilii bulbus中的OTA和ST的预测准确率均为100%。
结论
：本研究为可食用和药用植物中的霉菌毒素风险管理及早期预警提供了有价值的见解，有助于保护公众健康。
引言
霉菌毒素是一类由丝状真菌产生的次级代谢物，广泛污染可食用和药用植物（EMPs），对人类健康构成严重威胁。最常见的霉菌毒素包括黄曲霉毒素（AFs）、赭曲霉毒素（OTA）、伏马菌素（FBs）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和Alternaria毒素（Woo等人，2024年；Zhao等人，2022年；Zhou等人，2023年），这些毒素均由Aspergillus、Fusarium和Alternaria等产毒真菌产生。其中，AFs和OTA主要来源于Aspergillus（Chtioui等人，2023年；Khan等人，2021年），FBs和ZEN来源于Fusarium（Corallo等人，2023年），而Alternaria毒素来源于Alternaria（Xu等人，2024年）。这些霉菌毒素具有广泛的毒性，包括致癌性、肾毒性、肝毒性和神经毒性（Nagda & Meena，2024年；Omotayo等人，2019年；Rocha等人，2014年；Wu等人，2023年）。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）、OTA、FB1和ZEN受到全球关注：国际癌症研究机构（IARC）将AFB1列为1类致癌物，OTA和FB1列为2B类致癌物，ZEN列为3类致癌物（Ostry等人，2017年）。霉菌毒素问题引起了全球的广泛关注，促使许多国家和国际组织制定了多种基质中霉菌毒素的最大残留限量（MRLs）（中国药典委员会，2020a；FAO/WHO，2015年）。因此，准确检测各种基质中的微量霉菌毒素变得至关重要。目前，官方认可的霉菌毒素检测方法主要分为两大类：快速筛查方法和色谱技术。快速筛查方法（如侧向流动免疫测定）由于易出现假阳性而应用受限，而色谱技术因其更高的准确性而得到广泛应用。其中，超高效液相色谱与四极杆离子阱质谱联用（UPLC-Q-TRAP-MS）在多反应监测（MRM）模式下表现出优异的性能，成为微量霉菌毒素检测的主流方法（Liao等人，2023年；Lu等人，2022年）。
富含油脂和淀粉等营养成分的可食用和药用植物（EMPs）为真菌生长提供了理想条件，因此更容易受到霉菌毒素的污染。这些植物既可食用又具有药用价值，通过饮食和药物两种途径可能导致人类接触霉菌毒素。这种暴露情况的复杂性加剧了健康风险，这一问题已引起全球关注。因此，对这些植物进行霉菌毒素健康风险评估对于确保质量和消费者健康至关重要。蒙特卡洛模拟（MCS）通过随机采样和迭代计算暴露相关变量，可以构建完整的暴露值概率分布，已被广泛应用于各种基质中的霉菌毒素暴露风险评估（Chhaya等人，2025年；Liu等人，2024年；Yazdanfar等人，2022年）。风险评估方法通常分为两类：确定性和概率性暴露评估模型。概率性暴露模型能够评估不同暴露分布百分位下的霉菌毒素摄入量，从而实现精确的风险评估。
虽然霉菌毒素检测无法追踪污染源，但鉴定真菌群落组成对于早期预防霉菌毒素至关重要（Jiang等人，2024年）。高通量测序等分子鉴定技术广泛应用于真菌群落分析，依赖于短读长技术。受短读长限制，该方法通常仅针对部分内部转录间隔区（ITS）进行检测（Nilsson等人，2019年）。这一限制导致分类分辨率不足，尤其是在亲缘关系密切的物种之间，片段组装存在歧义，且复杂基因组的覆盖不均匀，难以在全球范围内比较微生物多样性。相比之下，第三代单分子实时（SMRT）测序结合了ITS1和ITS2区域的优点，实现了ITS区域的高通量全长测序。凭借超长读长、高准确性和均匀的基因组覆盖，该技术能够精确鉴定真菌物种并分析群落多样性，有效克服了传统短读长测序在物种鉴定方面的局限性（Wang等人，2024年）。近年来，它在分析食品中的真菌多样性方面展现了独特优势和广阔前景（Long等人，2022年；Wang等人，2024年）。
为了实现霉菌毒素的快速现场检测，近红外光谱（NIRS）近年来受到越来越多关注，因其具有无损性、快速性、无需试剂操作和现场适用性等优势。然而，NIRS存在谱峰重叠的问题，需要使用先进的化学计量工具来提取关键光谱信息。机器学习为解决这一挑战提供了新方法。与传统化学计量方法相比，机器学习能够高效处理大规模样本并提取与霉菌毒素相关的特征波长，从而实现快速准确的霉菌毒素检测（Bailly等人，2024年）。最近，机器学习与NIRS结合应用于谷物中霉菌毒素的快速筛查（Zhang等人，2025年；De Girolamo等人，2019年），已成为食品质量控制中霉菌毒素检测的一个热点领域。
因此，本研究旨在实现以下目标（图1）：(i) 建立一种准确灵敏的UPLC-Q-TRAP-MS方法，用于分析来自中国不同地区的259批富含油脂和淀粉的EMPs中的多种霉菌毒素，包括76批Coicis semen、49批Ziziphi spinosae semen、90批Lilii bulbus和44批Vignae semen>；(ii) 使用MCS构建概率评估模型，评估食用受污染植物后的霉菌毒素暴露风险；(iii) 通过SMRT测序鉴定代表性样本中的真菌群落多样性并识别潜在的产毒真菌；(iv) 对Coicis semen中的AFB1和ZEN以及Lilii bulbus中的OTA和ST，建立结合NIRS和机器学习的方法进行目标霉菌毒素的快速现场筛查。这些结果将为评估复杂EMPs中的霉菌毒素暴露风险提供关键支持，并为霉菌毒素早期预警策略提供依据。
方法部分
化学物质和试剂
霉菌毒素的参考标准品，包括黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2）、伏马菌素（FB1、FB2和FB3、赭曲霉毒素（OTA、OTB和OTC）、单甲基链格孢醇（AOH）、单甲基链格孢醇（AME）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、玉米赤霉烯酮（ZAN）、链格孢毒素（ST）、T-2毒素（T-2）和tentoxin（TEN），均从Pribolab Pte. Ltd.（新加坡）购买，纯度均≥98.0%。所有目标霉菌毒素的详细结构和信息见图S1和表格方法验证
根据相关法规（欧洲委员会，2021年），对开发的UPLC-Q-TRAP-MS方法进行了实际适用性评估。使用UPLC-Q-TRAP-MS准确定量微量霉菌毒素时，EMPs中的许多复杂成分可能会干扰目标分析物的电离效率，导致信号增强或抑制，这种现象称为基质效应（ME）。这里评估了Coicis semen、Ziziphi spinosae semen、Lilii bulbus和Vignae中的19种霉菌毒素的基质效应
结论
具有显著食用和药用价值的可食用和药用植物在全球范围内被广泛消费，但容易受到霉菌毒素污染，导致重大经济损失。本文提出了一种结合UPLC-Q-TRAP-MS、SMRT和NIRS的实际策略，用于实际可食用和药用植物中的霉菌毒素检测和早期预警。
结果表明，AFs、ST、FBs、OTA、ZEN和AOH是最常检测到的霉菌毒素，Aspergillus、Fusarium和Alternaria是主要的产毒真菌
作者贡献声明
方玲：概念设计、方法学、数据管理、验证、撰写初稿。
刘晓康：验证、撰写初稿。
刘康楠：数据管理。
冯林：实验研究。
唐子军：正式分析。
李振伟：监督。
张代迪：监督。
杨文志：概念设计、监督、数据管理。
郭德安：监督、项目管理和资金筹集。
作者贡献声明
方玲：撰写初稿、验证、方法学、数据管理、概念设计。
刘晓康：撰写初稿、验证。
刘康楠：数据管理。
冯林：实验研究。
唐子军：正式分析。
李振伟：监督。
张代迪：监督、概念设计。
杨文志：监督、数据管理、概念设计。
郭德安：监督、项目管理和资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金[项目编号82130111]和国家中医药管理局岐黄首席科学家项目（2020年）的财政支持。
