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化学工业品胚胎毒性预测方法研究。采用斑马鱼胚胎化学孵育与微注射结合方式，评估8种工业化学品的胚胎毒性，包括3种UVCBs和5种低水溶性物质。通过LC50、EC50和NOAEL参数计算致畸指数（TI），验证该方法与现有哺乳动物实验的一致性。结果显示斑马鱼胚胎测试能准确预测89%样品的胚胎毒性，尤其在区分高/低风险物质方面表现优异，为复杂化学品安全性评价提供新工具。
安德烈亚·M·J·韦纳（Andrea M.J. Weiner）| 罗维娜·雷伯恩（Rowena Raeburn）| 阿兰查·穆里亚纳（Arantza Muriana）| 利昂·罗克特（Leon Rockett）| 雅典娜·M·基恩（Athena M. Keene）
BBD BioPhenix SLU（BIOBIDE），西班牙圣塞巴斯蒂安Mikeletegi路56号
摘要
需要开展研究来探讨成分未知或可变、复杂反应产物或生物材料（UVCBs）以及难以检测的物质（包括水溶性低的物质）对人类的潜在毒性。斑马鱼胚胎已被提出作为一种新的方法学（NAM），可以用于研究化学物质的胚胎毒性。通过化学孵化和显微注射方法，在斑马鱼胚胎中测试了八种难以检测的物质，包括多种UVCBs和水溶性低的物质，最初是为了确定诱发畸形和致死性的条件和浓度。随后进行了决定性实验，并根据致死性和胚胎毒性参数（LC50、EC50和NOAEL）计算了致畸指数（TI）值。这些物质之前都已在经过验证的哺乳动物实验中进行了生殖或胚胎毒性测试。斑马鱼实验正确预测了三种在哺乳动物生殖或发育实验中未显示胚胎毒性的物质。对于另外五种根据之前的哺乳动物实验被归类为具有发育毒性的物质，斑马鱼实验也正确预测了其中三种。未被斑马鱼实验正确预测的两种物质在哺乳动物发育筛选实验中产生的影响较轻。使用斑马鱼发育毒性实验来筛选UVCBs和难以检测的物质，成功确定了它们的胚胎毒性潜力。该实验有助于确定物质的测试优先级，或作为监管提交中的证据之一。
引言
需要工具来预测工业化学品的胚胎毒性潜力，因为早期生命阶段对某些化学品可能更为敏感。使用动物模型已被证明是与人类和环境毒性相关的测试中最适用的方法之一[1]、[2]。将斑马鱼作为新的方法学（NAM）用于模拟脊椎动物生物学得到了许多因素的支持，包括其体积小、繁殖能力强、外部发育迅速、早期生命阶段透明以及易于进行基因操作[3]。这些因素，加上由于脊椎动物胚胎发生过程保守而具有的可转化生物学特性[4]、[5]、[6]，表明斑马鱼模型是一种有效的筛选方法，能够为哺乳动物的发育危害提供相关答案[7]、[8]、[9]。
斑马鱼胚胎毒性测试（ZET）是通过将刚受精的斑马鱼卵浸入含有已知量测试物质的液体溶液中进行的（化学孵化）。该实验按照时间表在受精后2天和4天观察胚胎。暴露后，通过视觉形态学评估研究几个感兴趣的终点。对于由于物理化学性质难以溶解或预计因分子量高而难以渗透到胚胎中的化学物质，可以采用替代处理方法。在这种情况下，将测试物质溶解在适用的溶剂中，然后用超纯水进一步稀释后，在胚胎早期阶段进行显微注射。在某些情况下，显微注射可以提高测试物质的生物利用度和输送均匀性。ZET之前已成功用于测试一些难以检测的物质，包括石油物质的二甲基亚砜（DMSO）提取物[10]，目前正使用ICH S5(R3)指南中列出的参考化学物质进行验证[11]。
对于这项研究，根据欧洲化学品管理局（ECHA）化学品数据库中公开的大鼠生殖和/或发育测试数据（
https://chem.echa.europa.eu/），选择了八种工业测试物质进行测试。虽然这些测试物质具有不同的特定用途，但它们都被用作润滑剂行业的功能流体。这些测试物质还具有使其成为难以检测物质的特性（见补充表1中列出的关键物理化学性质）。庚酸、1-十八烯、钠-N-月桂酰肉碱、烷基苯并三唑和2,4,6-三叔丁基酚的水溶性都很低，因此需要用DMSO配制储备溶液用于显微注射实验。酚类、(四丙基)衍生物、S-烯基-O,O-二烷基二硫磷酸酯、烷基苯并三唑和脂肪酸、3-(十二烯基)二氢-、2,5-呋喃二酮的反应产物以及多组分或成分未知/可变、复杂反应产物或生物材料（UVCBs）无法用单一化学结构表示。其中许多物质还符合经合组织指导文件23中描述的难以检测物质的特性[12]。尽管该文件专门针对水生测试，但满足这些标准也可能使哺乳动物测试更加具有挑战性，因为通常需要生成水溶液来稀释测试物质。此外，UVCB物质在哺乳动物实验中往往难以测试，因为很难或不可能确定通过饮食或饮用水实现的分析方法。钠-N-月桂酰肉碱是一种阴离子表面活性剂，这是经合组织23指导文件中特别提到的物质类别。
生殖和发育测试数据总结在补充表1中。选择了三种在OECD 443扩展一代生殖毒性研究[13]或OECD 414产前发育毒性研究[14]中均未引起生殖或发育效应的测试物质作为对照物质（庚酸、1-十八烯和钠-N-月桂酰肉碱）。还选择了两种根据ECHA分类、标签和包装（CLP）法规附件VI中的生殖毒性1B类列表而被认为是生殖或发育毒物的测试物质。酚类、(四丙基)衍生物在OECD 416二代生殖毒性研究中引起了严重的生殖和发育效应，包括着床点数量减少和出生后存活率下降。在OECD 414的大鼠研究中还显示了骨骼畸形增加。2,4,6-三叔丁基酚在OECD 422联合重复剂量毒性研究中被证明是发育毒性物质，其效应包括出生后损失增加[16]、活幼崽数量减少和幼崽体重降低。最后，选择了三种在其各自档案中自归类为生殖毒性2类的物质；脂肪酸、3-(十二烯基)二氢-、2,5-呋喃二酮的反应产物和多胺在OECD 422或421筛选测试中分别引起了一些生殖和发育效应[17]，而烷基苯并三唑在OECD 414实验中引起了发育效应。脂肪酸、3-(十二烯基)二氢-、2,5-呋喃二酮的反应产物和多胺由于延长了交配前时间、怀孕母鼠数量减少和出生后存活率降低而影响了总体生殖性能。S-烯基-O,O-二烷基二硫磷酸酯导致生育能力和幼崽体重下降。烷基苯并三唑导致胎儿体重减轻、骨骼和内脏变化以及性别比例变化。
使用化学孵化和显微注射两种暴露方法在斑马鱼胚胎中评估了测试物质。首先确定了引起形态改变和致死性的浓度。其次，通过绘制剂量-反应曲线计算致死性和胚胎毒性参数（LC50、EC50和NOAEL）后，确定了致畸指数（TI），从而确定了测试物质的胚胎毒性潜力。
部分内容
动物饲养和伦理
野生型成年斑马鱼（Danio rerio，AB背景）按照已发布的指南[18]、[19]在独立系统中饲养和维护。鱼类在27 ± 2oC的温度下饲养，光照周期为14小时/10小时黑暗周期，水中持续过滤，pH值为7-7.8，电导率为500-800 μS，氧气饱和度为60–90%。成年鱼每天两次喂食磨碎的干颗粒（Gemma 300，Skretting）和卤虫（Catvis）。繁殖通过群体交叉进行。
剂量范围研究（DRF）的结果
表1展示了通过孵化和显微注射处理斑马鱼胚胎后获得的DRF结果。目的是确定每种方法评估发育缺陷的最适当浓度范围。每个框分别显示了没有明显变化的胚胎数量、受影响的胚胎数量和死亡的胚胎数量。对于所有测试物质（1-十八烯除外），在孵化实验中
讨论
本项目的目的是确定ZET是否可以成功用作难以检测的工业化学品（包括水溶性低的物质和UVCBs）的发育毒性筛选方法。尽管该实验经过了各种系统性审查、验证和使用ICH S5(R3)指南[9]、[11]的资格测试，但用于验证工作的测试物质更多是药物化合物而非工业化学品
结论
总体而言，ZET能够成功确定多种工业化学品（包括UVCBs和水溶性低的化学品）是否可能引起发育效应。该实验更准确地预测了那些在哺乳动物实验中显示出显著或无胚胎毒性的测试物质的胚胎毒性潜力，而对于在哺乳动物实验中引起较轻微效应的化学品，则预测能力较差
资助
所有工作均由Afton Chemical Corporation资助。
CRediT作者贡献声明
雅典娜·M·基恩（Athena M. Keene）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、概念化。利昂·罗克特（Leon Rockett）：撰写 – 审稿与编辑。阿兰查·穆里亚纳（Arantza Muriana）：撰写 – 审稿与编辑、概念化。罗维娜·雷伯恩（Rowena Raeburn）：撰写 – 审稿与编辑。安德烈亚·M·J·韦纳（Andrea M.J. Weiner）：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、数据管理、概念化。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：安德烈亚·M·J·韦纳与BBD BioPhenix SLU（BIOBIDE）存在关系，包括就业。罗维娜·雷伯恩与Afton Chemical Corporation存在关系，包括就业。阿兰查·穆里亚纳与BBD BioPhenix SLU（BIOBIDE）存在关系，包括就业和股权。利昂·罗克特与Afton Chemical存在关系
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。术语表
- 3R原则
- 强调替代、减少和优化动物实验的框架。
- 附件VI
- 欧洲分类、标签和包装法规的附件，其中包含欧盟所有危险物质的统一分类列表。
- CLP
- 分类、标签和包装法规
- DMSO
- 二甲基亚砜。一种广泛使用的溶剂。
- dpf
- 斑马鱼胚胎受精后的天数。
- DRF
- 剂量范围研究，用于确定相关
