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PNMC通过剂量依赖性影响KGN细胞线粒体稳态和类固醇生成，低浓度（100μM）上调动态相关基因和抗氧化基因，高浓度（1mM）导致线粒体毒性。关键酶CYP19A1在100μM显著激活，而CYP17A1等在1μM响应最强，提示PNMC生殖毒性机制与线粒体功能失调密切相关。
Jingyi Xie|Zixuan Pan|Yuhan Du|Kexue Li|Yuning Liu|Qiang Weng|Haolin Zhang
北京林业大学生物科学技术学院，北京，100083，中国
摘要
3-甲基-4-硝基酚（PNMC）是一种广泛存在于环境中的内分泌干扰物，来源于柴油颗粒物和芬硫磷的降解过程，可能对卵巢功能构成潜在风险。本研究使用人卵巢颗粒细胞系KGN，探讨了PNMC在不同浓度（1nM至1mM）下对线粒体稳态和类固醇生成的影响。细胞在含有PNMC的培养基中培养48小时后，对其线粒体动态和功能以及类固醇生成进行了评估。转录和免疫荧光分析显示，100μM浓度的PNMC显著上调了与线粒体动态相关的基因（MFN1/2、OPA1和DRP1）、与线粒体自噬相关的基因（PINK1和PARK2）以及抗氧化防御相关的基因（SOD1/2和GPX1）的表达。这些变化伴随着线粒体DNA拷贝数的增加、细胞内活性氧（ROS）的减少以及线粒体膜电位的升高。相反，1mM浓度的PNMC引发了明显的线粒体毒性，表现为线粒体DNA含量下降、ROS水平升高、膜电位丧失以及细胞活力显著降低。结果表明，PNMC显著改变了与线粒体动态、抗氧化防御和线粒体自噬相关的基因表达。CYP19A1基因在100μM浓度下表达显著上调，而其他基因（CYP17A1、CYP11A1、HSD3B）的最大反应出现在1μM浓度下。相应地，在100μM或1μM浓度的PNMC处理下，培养基中的17β-雌二醇和孕酮水平也有所增加。综上所述，PNMC对类固醇生成功能的干扰与其引起的线粒体活性改变密切相关，为揭示其潜在的生殖毒性提供了重要的机制见解。
引言
随着工业化的加速和生活方式的变化，内分泌干扰物（EDCs）已成为全球环境和公共卫生的关注焦点。作为广泛分布的外源性污染物，EDCs通过模仿、拮抗或干扰生理过程来破坏内分泌功能，对健康和生态系统构成威胁[1]。接触EDCs与多种疾病有关，包括生殖系统疾病、代谢疾病、神经发育障碍和癌症[2][3]。EDCs通过干扰性激素的合成和代谢，影响配子生成和激素稳态，导致精子质量下降、月经不调、多囊卵巢综合征（PCOS）和不孕症[4][5][6]。它们还可能通过干扰甲状腺激素和胰岛素信号通路，增加肥胖和糖尿病的发病风险[7]。值得注意的是，EDCs的毒性机制多种多样，不仅限于直接的受体相互作用，还涉及DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传修饰，从而长期改变基因表达[8][9]。最新研究还表明，即使是低剂量的EDCs也可能引发显著的生物学反应[10][11]。
3-甲基-4-硝基酚（PNMC）主要来源于车辆尾气排放，同时也是有机合成过程中的副产物，以及农药芬硫磷的主要降解产物（约占50%）[12][13]。人类主要通过吸入空气中的颗粒物、接触受污染的表面或农药制剂，以及通过食物链或饮用水摄入而暴露于该物质[14]。研究表明，PNMC具有内分泌干扰作用，会对人类健康造成威胁，包括通过干扰生殖细胞动态和卵母细胞成熟而导致生殖功能受损[15]。PNMC还会干扰生物钟基因的表达，影响小鼠的早期卵泡发育[16]，为评估其对女性生殖健康的危害提供了关键证据。
线粒体是高度动态的细胞器，通过融合、分裂和线粒体自噬表现出结构和功能的可塑性。这些过程对于质量控制、功能维持以及参与细胞凋亡、应激反应和疾病过程至关重要[17]。正常的线粒体功能对于维持细胞增殖、活力和内分泌活性至关重要[18]。越来越多的证据表明，线粒体动态在细胞调节中起着关键作用，其紊乱与多种疾病的发生密切相关，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。在癌细胞中，线粒体动态的失衡与增殖增强、代谢重编程和侵袭性增加有关[19]。例如，分裂蛋白DRP1的上调与增殖和凋亡抑制相关，而融合蛋白MFN1/2的下调则与侵袭性和转移性增加相关[20]。线粒体动态还介导细胞对营养变化的适应，如饥饿条件下的形态和功能改变[21]。
在卵巢生理中，线粒体不仅是细胞ATP的主要来源，还是颗粒细胞中类固醇生成、氧化还原稳态和凋亡信号传导的关键调节节点。正常的线粒体动态支持卵母细胞成熟、卵泡生长和黄体形成[22]。相反，线粒体功能障碍与卵巢疾病（如PCOS、原发性卵巢功能不全和与年龄相关的生育能力下降）密切相关[23][24]。过度的分裂和代谢紊乱常导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[25]，而维持线粒体完整性则有助于类固醇生成和卵泡存活[26]。重要的是，线粒体功能障碍已被确定为多种EDCs引发细胞损伤的常见途径[27]。例如，双酚A和邻苯二甲酸酯可引发线粒体氧化应激，损害能量产生并激活凋亡[28]。同样，重金属镉作为一种环境内分泌干扰物，会干扰激素合成和代谢信号传导，并通过线粒体功能障碍促进KGN细胞的凋亡[29]。尽管已有许多研究探讨了EDCs如何干扰人卵巢颗粒细胞的功能，但它们对这些细胞线粒体稳态的影响仍不明确。
本研究旨在使用人卵巢颗粒细胞系KGN，探讨PNMC对线粒体稳态和类固醇生成的影响。我们检测了PNMC对线粒体动态和线粒体自噬相关基因表达、线粒体DNA拷贝数及膜电位的影响，并比较了对照组和PNMC处理组之间的抗氧化防御基因表达以及细胞内和线粒体内的活性氧水平。此外，还评估了PNMC对类固醇生成酶表达的影响。这项工作有助于阐明PNMC在人颗粒细胞中的生殖毒性机制，并加深了对EDCs如何引发细胞功能障碍的理解。
实验部分
细胞制备
KGN人颗粒细胞系（CL-0603，Procell Life Science & Technology Co., Ltd.，武汉，中国）通常在专用的细胞培养基（CM-0603，Procell Life Science & Technology Co., Ltd.，武汉，中国）中培养，并在标准培养条件（37℃，5% CO?）下的湿润培养箱中维持。细胞接种到T25培养瓶后24小时，不同处理组分别加入1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM或1mM的PNMC（溶于绝对二甲甲醇中）进行处理
PNMC对KGN细胞活力的影响
为了评估PNMC对KGN细胞活力的影响，使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒在PNMC浓度为1nM至1mM的条件下处理48小时后测量细胞活性（见补充图S1）。结果显示，在1nM至100μM的浓度范围内，DMSO对照组与各处理组之间的细胞活力无显著差异。然而，在1mM浓度的PNMC处理组中，细胞活力显著降低
讨论
PNMC是一种普遍存在的内分泌干扰物，其广泛分布引发了对其对人体健康不良影响的担忧。为了研究PNMC对人类颗粒细胞功能的影响，选择了较宽的浓度范围（1nM至1mM）进行暴露实验。这一设计基于目前缺乏关于人卵泡液中PNMC浓度的直接数据。
CRediT作者贡献声明
Kexue Li：实验研究。Zixuan Pan：实验研究。Yuhan Du：实验研究。Jingyi Xie：撰写——初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据整理、概念构思。Haolin Zhang：撰写——审稿与编辑、方法学设计、资金筹集、概念构思。Yuning Liu：撰写——审稿与编辑。Qiang Weng：撰写——审稿与编辑、资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。
致谢
本研究得到了北京市自然科学基金（7232240）和中国国家自然科学基金（32270519）的支持。
