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本平台整合DNA逻辑纳米装置与染料负载DNA信号放大器，实现miRNA、ATP和pH等多维度生物标志物的逻辑检测与可视化输出，提升疾病诊断特异性与精准度。
杨思慧|肖志慧|王淼|王丽丽|唐艳华
中南大学衡阳医学院附属第一医院，湖南衡阳421001
摘要
鉴于疾病的高度变异性和复杂性，全面而精确地识别包括遗传、代谢和微环境因素在内的多维生物标志物对于减少假阳性结果和提高诊断准确性至关重要。在这里，我们报道了一种多输入DNA逻辑计算与可视化（MDLV）平台，该平台将模块化的布尔逻辑门与DNA功能化的信号放大器集成在一起，用于多维生物标志物的全面识别、逻辑分析和可视化读出。MDLV平台使用可编程的DNA逻辑纳米设备在微孔板上执行高阶布尔运算（包括YES、AND和NIMPLY），并创新性地整合了含有染料的DNA纳米颗粒作为信号放大器，以实现灵敏的颜色测定输出。通过将各种“即插即用”的识别探针纳入逻辑处理系统，我们成功实现了遗传生物标志物（miRNA）、代谢分子（ATP）和微环境指标（pH）的组合和逻辑检测。值得注意的是，通过3输入AND和NIMPLY逻辑门的协同作用，我们实现了肿瘤样本原发性和转移性特征的区分。这种逻辑计算与可视化读出的无缝集成为多维生物标志物诊断提供了一种新方法，展示了其在精准医疗和个性化医疗中的进一步潜力。
引言
检测疾病特异性生物标志物在基础医学、临床诊断和预后评估中具有重大潜力[1]、[2]。实现多目标集成诊断对于克服单一生物标志物检测的局限性至关重要，例如置信度有限、假阳性和特异性不足[3]。多维生物标志物是指来自不同维度的异质性生物标志物，包括遗传、代谢组学、蛋白质组学和微环境分子，最近被提出用于提供疾病的全面和准确概况[4]、[5]、[6]。具体来说，研究表明，在肿瘤相关疾病中，基因转录调节因子microRNA（miRNA）的表达谱发生了显著变化[7]、[8]、[9]，伴随细胞器功能障碍和细胞能量代谢失调[10]、[11]、[12]。同时，组织过度积聚会导致局部循环受阻和缺氧，引发乳酸积累和微环境酸化[13]、[14]、[15]。这些多方面因素共同影响和调节疾病的发生和发展。因此，全面监测多维生物标志物对于实现精确诊断和治疗至关重要。
目前，由于来自不同检测平台的数据类型差异、缺乏通用的多重识别工具以及交叉反应的风险[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]，在多维背景下实现全面检测仍然具有挑战性。在这种情况下，DNA纳米技术作为一种有前景的集成生物标志物传感平台应运而生，因为它具有出色的可编程性、设计灵活性和生物相容性[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。DNA的功能多样性使其能够通过适配体和i-基序等功能性核酸特异性识别多种生物分子，以及通过toehold介导的链位移等动态反应[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。这些特性为建立“一站式”检测平台提供了分子基础。值得注意的是，通过将这些识别工具包与DNA逻辑电路[39]、[40]集成，可以通过模块化设计处理多种分子输入，执行布尔逻辑运算，生成组合和精确诊断所需的输出[41]、[42]。然而，目前的努力主要集中在单维或二维布尔运算上，通常处理多个miRNA及相关表达蛋白等输入。除了这些目标外，细胞能量代谢物和局部微环境也是疾病发展和进展的活跃调节因素，对于准确描述疾病状态至关重要。因此，将DNA逻辑计算扩展到第三个维度，整合遗传、代谢和微环境指标是必要的。这一进展有望通过捕捉更全面的病理图谱来提高诊断的特异性和准确性。
此外，为了提高检测灵敏度，大多数现有的逻辑分析平台都结合了DNA级联电路，包括催化发夹组装（CHA）[43]、[44]、熵驱动催化（EDC）[45]和杂交链反应（HCR）[46]、[47]、[48]，用于信号放大，这些方法通常依赖于特定的仪器进行信号采集。虽然这些方法有效，但增加了整体设计复杂性，并引入了非特异性相互作用、逻辑判断效率降低和电路泄漏风险等潜在缺点。这些限制共同使操作程序复杂化，并限制了逻辑传感器在资源有限环境中的实际应用。作为一种替代方案，自组装的纳米颗粒封装了多种染料分子，为信号放大策略提供了强大的途径[49]、[50]。这些纳米颗粒通常通过疏水相互作用、氢键和范德华相互作用由疏水染料分子和稳定剂共组装而成，具有亲水外壳和疏水核心。它们在特定刺激下快速释放染料，从而产生易于视觉解释的明显颜色变化[51]。我们提出，通过将两亲性DNA的脂质部分插入疏水核心来功能化这些纳米颗粒，不仅可以提高组装稳定性，还可以在其表面赋予它们功能性的DNA链。这种设计使纳米颗粒具有特定的识别能力，使其成为逻辑操作的定向和放大输出的信号标签。尽管具有这种潜力，但尚未探索将这种DNA功能化的、载有染料的纳米颗粒作为DNA逻辑分析平台的视觉信号放大器的应用。
在这里，我们开发了一种多输入DNA逻辑计算与可视化（MDLV）平台，该平台集成了生物识别、布尔逻辑计算和视觉信号输出，实现了多维生物标志物的逻辑检测和分析（图1）。通过合理设计可编程的DNA逻辑纳米设备，并创新性地整合A-DNA@TP（用脂质修饰的两亲性DNA功能化的噻吩酚酞纳米颗粒）作为信号放大器，我们实现了异质生物标志物的组合和精确检测，包括遗传生物标志物（miRNA）、代谢分子（ATP）和微环境指标（pH）。具体来说，基于DNA的逻辑纳米设备被设计在微孔板上，用于执行布尔运算（包括YES、AND和NIMPLY），以组合识别和分析多维生物标志物，从而暴露特定的DNA锚点。随后，信号放大器A-DNA@TP会特异性识别并结合这些解锁的DNA锚点，实现信号放大和视觉输出。因此，输出信号既适合肉眼解读，也适合快速仪器检测，便于简单、高效和准确的疾病二进制解码。该平台具有改进的传感逻辑，并增加了信号输出控制终端，确保仅在添加A-DNA@TP时才生成信号，从而防止泄漏引起的背景噪声并保证逻辑可靠性。此外，它展示了出色的设计灵活性和可操作性，能够为不同的诊断需求定制布尔函数设计。总体而言，MDLV平台为多维生物标志物诊断建立了一个多功能和强大的框架，展示了在精准癌症诊断和个性化医疗中的巨大潜力。
试剂和设备
详细信息见支持材料。
A-DNA@TP的制备和表征
A-DNA@TP的合成是在先前报道的共组装方法的基础上进行了改进[49]。为了制备A-DNA@TP，依次将100μL 20mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）、40μL 20mg/mL的噻吩酚酞（TP，溶解在DMSO中）和200μL 10μM的A-DNA加入到1,660μL的PBS溶液中，在低温下连续搅拌3小时。之后，将混合物在10,000rpm下离心5分钟进行纯化
MDLV平台的工作原理
如图1所示，MDLV平台的工作流程包括三个步骤：多目标识别、逻辑分析和视觉读出。首先，通过模块化的“即插即用”DNA识别探针（R-DNA）来设计平台对多维生物标志物（例如miRNA、ATP、酸性pH）的特异性，这些探针利用toehold介导的链位移进行核酸识别，利用适配体构象切换进行小分子识别，以及利用i-基序结构折叠进行pH识别
结论
总结来说，我们开发了一个多维生物标志物识别平台MDLV，它将DNA逻辑纳米设备与含有染料的DNA信号放大器集成在一起。该平台能够实现遗传、代谢和微环境类别的异质生物标志物的组合识别、逻辑分析和颜色测定检测。合理设计的基于DNA的信号放大器能够有效响应逻辑运算结果，从而实现快速和颜色测定的信号
CRediT作者贡献声明
杨思慧：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。肖志慧：验证、数据分析、监督、资金获取、数据分析。王淼：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念化。王丽丽：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析、概念化。唐艳华：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、数据分析
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号22504055、22174059和82400710）、湖南省科技创新计划（编号2022RC1230）、湖南省自然科学基金（编号2026JJ60135）、湖南省教育厅科学研究基金（编号25C0257）和中国博士后科学基金（编号2025M772761）的财政支持。
杨思慧 研究方向：杨博士专注于功能性核酸纳米技术、基于DNA的生物传感平台以及用于疾病生物标志物检测的信号放大策略。近年来，她作为第一作者/通讯作者在《自然化学生物学》和《食品化学》等高影响力期刊上发表了多篇学术论文。
