《The Journal of Antibiotics》：Euglena gracilis as a high-throughput screening platform for antibacterial activity, cytotoxicity and membrane permeability in a one-step and cost-effective assay
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为解决细菌耐药性加剧背景下新型抗菌药物研发的迫切需求，研究人员基于眼虫( Euglena gracilis)的独特生物学特性，开发了一种可同时筛选化合物抗菌活性（漂白效应）、真核细胞毒性（存活与否）及跨膜能力（穿越至少三层膜）的新型一体化、低成本高通量筛选平台。该平台经优化验证，可有效从已知及天然产物库中识别潜在抗菌候选物，为发现具有新靶点、低毒性、高透膜性的抗菌药物提供了高效工具。
抗生素的发现是二十世纪医学的里程碑，显著降低了传染病的致死率。然而，这场对抗细菌感染的战役远未结束，细菌耐药性问题日益严峻，已成为全球公共卫生的重大威胁。多重耐药病原体导致的感染占住院感染的15%，某些甚至已无有效抗生素可用，全球每年因此死亡的人数约达500万。与此同时，新型抗菌药物的研发管线却相对匮乏，自“抗生素黄金时代”后，新药发现的速度已大幅放缓。传统的筛选方法，如针对特定靶点的筛选，在抗菌药物领域收效不佳，成本高昂且难以发现具有新作用机制的化合物。此外，现有抗生素的作用靶点主要局限于转录、翻译和细胞壁合成等少数几个通路，化学类别也相对单一，这为细菌留下了广阔的耐药和逃逸空间。因此，开发能够从海量化合物库中高效、低成本地初步筛选出具有潜在抗菌活性、低毒性及良好膜通透性的候选分子的新方法，成为当前抗菌药物研发领域的迫切需求。
针对这一难题，一项发表在《The Journal of Antibiotics》上的研究提出并验证了一种基于单细胞真核生物——纤细眼虫( Euglena gracilis)的高通量筛选平台。眼虫是一种混合营养型的原生生物，它通过次级内共生获得了一个叶绿体。这个源自蓝细菌的叶绿体保留了一些细菌特征，使其成为某些抗生素的靶点。当作用于细菌的抗生素（如抑制蛋白质或DNA合成的药物）作用于眼虫时，会导致其叶绿体丢失，从而使绿色的细胞“漂白”为白色。关键的是，由于眼虫具有混合营养能力，即使失去叶绿体，它仍能利用培养基中的有机碳源继续生长。这一独特生物学特性，使得在单一实验体系中，通过观察细胞颜色（绿、白、清）和生长状况，即可一次性评估化合物的三种关键属性：（i）潜在的抗菌活性（导致漂白）、（ii）对真核生物的低毒性（细胞存活并生长）以及（iii）跨膜能力（化合物需穿越真核细胞膜、叶绿体的多层膜等屏障）。研究者认为，这种“一石三鸟”的筛选策略，有望高效识别出那些能有效对抗细菌、对宿主细胞毒性低、且能穿透细胞膜（包括对抗难治的革兰氏阴性菌所需的跨膜能力）的候选药物分子。
为验证这一设想，研究人员开展了一系列工作。他们首先建立并优化了基于眼虫的筛选体系的所有关键参数，包括确定最佳细胞接种密度（3 × 104个细胞/毫升）、培养条件（28°C，12小时光暗循环，4天即可读数，条件简易）、以及用于自动化区分“生长”（绿色）、“漂白”（白色）和“死亡”（澄清）结果的吸光度判读标准。他们定义了“漂白因子”为A680/A530，比值大于1为生长，小于等于1为漂白；并以A680吸光度值低于0.8（约为未处理细胞的一半）作为“死亡”的阈值。
在技术方法上，本研究主要依托几个核心环节：首先，使用Cramer-Myers培养基在特定条件下培养 Euglena gracilis。其次，构建和利用了两个化合物库进行筛选测试，一个是来自MedChemExpress的商业化合物库，另一个是来自亥姆霍兹感染研究中心（HIPS）的自组装稀有天然产物库（主要包含源自黏细菌和真菌的化合物）。最后，核心筛选实验在96孔板中进行，将眼虫细胞、待测化合物（及包括溶剂、阳性/阴性对照在内的多种对照）共培养后，使用酶标仪测量380-720 nm的吸光度谱，并依据前述定义的“漂白因子”和A680阈值，对化合物的效应进行自动化分类（生长/漂白/杀死）。整个流程旨在实现高通量、低成本的一体化初筛。
结果部分主要包括以下几个方面：
1. 实验方法的建立
研究成功优化了基于眼虫的筛选方案。通过比较不同96孔板类型，确定白色透明底板的再现性更佳。实验确定了最佳接种密度，并证实该体系具有鲁棒性，即使在室温窗台边培养、读数时间略有延迟，也不影响结果判定。通过用不同浓度的漂白性抗生素（链霉素、氧氟沙星）和杀灭性抗生素（腐草霉素）处理细胞并测量全波长吸光度谱，研究者定义了用于自动化区分三种结果的关键光学参数：漂白因子（A680/A530）和A680绝对值。
2. 对MedChemExpress化合物库的筛选
应用上述建立的方法对一个包含79种化合物的商业库进行筛选。结果成功鉴定出9种引起漂白的化合物和9种引起杀灭的化合物，其余61种无明显影响。在8种引起漂白的化合物中，5种是已知的原核翻译抑制剂（涵盖作用于30S和50S核糖体亚基的不同类别），3种是影响DNA复制的氟喹诺酮类抗生素。值得注意的是，其中一种漂白化合物甘非泊罗（Ganfeborole）是一种苯并氧杂硼杂环戊烯（benzoxaborole），其靶点是结核分枝杆菌的亮氨酰-tRNA合成酶，这首次证明了不直接作用于核糖体的翻译抑制剂也能引起眼虫漂白。筛选同时识别出一些对真核生物有毒性（导致死亡）的化合物，它们主要影响真核特异性或基础生命过程。
3. 对天然产物库的筛选
作为原理验证，研究团队筛选了一个包含88种稀有天然产物（主要来自黏细菌和真菌）的库。结果显示，18种化合物阻止了眼虫生长，其中许多作用于已知的真核靶点，如线粒体呼吸链、V-ATP酶、微管等。特别重要的是，发现一种化合物——银藻菌素C（Argyrin C）能引起明显的眼虫漂白。银藻菌素是一类已知具有抗菌和抗肿瘤活性的环状八肽，其作用靶点是线粒体延伸因子G（FusA1），从而抑制线粒体蛋白质合成。这一发现证明该筛选方法能够从结构复杂的天然产物库中识别出具有已知抗菌活性的化合物。
在讨论与结论部分，研究者强调了本研究的核心贡献与意义。面对多重耐药菌日益严重的威胁，本研究提出的基于眼虫的高通量筛选平台提供了一种新颖、高效且低成本的解决方案。其独特优势在于能在单一步骤中同步评估化合物的抗菌潜力（通过漂白现象）、真核细胞安全性（通过细胞存活与生长）以及跨膜能力（通过穿越包括真核细胞膜和原核来源的叶绿体膜在内的多重屏障），这种多重信息的整合是其他现有筛选方法难以实现的。该方法非常经济，眼虫培养要求简单（无需血清），实验周期短（4天），易于规模化，且适用于任何类型的化合物库（合成或天然），具有不局限于特定靶点、从而有可能发现作用于新靶点药物的潜力。
当然，该方法也存在一定的局限性，即可能漏筛（假阴性）那些作用于叶绿体中不保守的细菌靶点的药物（如细胞壁合成抑制剂），以及可能误筛（假阳性）那些特异性靶向光合作用而非必需细菌过程的化合物。因此，该平台被定位为抗菌药物研发流程的初筛环节，旨在从海量化合物中高效筛选出值得进入后续更复杂、更特异的下游验证的候选分子清单。
研究证实，该平台能有效识别作用于革兰氏阴性菌的抗生素（如链霉素、氧氟沙星），这对于应对当前最紧迫的、由多重耐药革兰氏阴性菌（如肠杆菌目、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等）带来的治疗挑战具有重要意义。此外，通过筛选，研究者不仅验证了已知能引起漂白的抗生素类别（如核糖体抑制剂、DNA旋转酶/拓扑异构酶IV抑制剂），还首次发现了两类新型的漂白化合物：靶向亮氨酰-tRNA合成酶的甘非泊罗和靶向延伸因子G的银藻菌素C，这证明了该筛选方法具有超越传统靶点、发现新型作用机制抗菌药物的潜力。
综上所述，这项研究成功开发并验证了以纤细眼虫为核心的一体化抗菌药物高通量初筛平台。在细菌耐药性可能成为未来几十年主要致死原因的严峻形势下，该研究为大规模、低成本地发现具有新靶点、低毒性、良好膜通透性的抗菌候选药物增添了一个强有力的新工具。
